测序技术原理（Sequencing Technology）¶
一句话说明¶
测序技术是把 DNA/RNA 的碱基序列"读"出来的方法，是所有基因组学和宏基因组学分析的数据源头——你项目里所有的 FASTQ 文件，都是测序仪产出来的。搞清楚测序原理，才能理解数据的优缺点，才知道后续分析该怎么做。
核心概念（白话版）¶
1. 测序是什么¶
- 定义：测序（Sequencing）就是确定一段 DNA 或 RNA 分子上碱基（A、T/U、G、C）的排列顺序的过程。
- 白话比方：把 DNA 想象成一本用 4 个字母（A、T、G、C）写的超长密码本，测序就是一个字一个字地把密码本的内容抄下来。
- 为什么需要测序：
- 想知道一个微生物是什么物种 → 需要读它的基因序列
- 想找疾病相关的基因突变 → 需要读病人的基因组
- 想分析肠道菌群组成 → 需要把粪便样本里所有微生物的 DNA 都读出来（这就是宏基因组测序）
2. 一代测序（Sanger 测序）¶
- 原理：
- 1977 年 Frederick Sanger 发明，也叫"链终止法"
- 白话解释：往 DNA 复制反应里掺入一种特殊的"终止碱基"（ddNTP，双脱氧核苷酸——简单说就是一种"坏零件"，装上去 DNA 链就没法继续延伸了），这种碱基一旦被掺进去，DNA 链就停止延伸了
- 因为终止碱基是随机掺入的，所以会产生各种长度的 DNA 片段
- 这些片段按长度排列，就能一个个读出碱基的顺序
-
现代 Sanger 测序用 4 种不同颜色的荧光标记 4 种终止碱基，通过毛细管电泳（Capillary Electrophoresis——利用电场让 DNA 片段按大小排队跑，小的跑快大的跑慢）把片段按长度分开，激光检测荧光颜色 → 自动读出序列
-
优缺点：
- 优点：准确率极高（>99.99%），是测序的"金标准"
- 缺点：一次只能读一条序列（约 600-1000bp），通量极低，成本高
-
不适合大规模测序任务（比如一个人类基因组有 30 亿个碱基）
-
现在还用吗：
- 还在用！主要用于：
- 验证 NGS 发现的突变（比如临床检测发现一个致病突变，用 Sanger 测序再确认一遍）
- 小片段的测序验证（比如质粒构建后验证插入片段是否正确）
- 16S rRNA 基因的全长测序（部分研究）
3. 二代测序（NGS / Illumina）¶
NGS = Next-Generation Sequencing（下一代测序），也叫"高通量测序"（High-Throughput Sequencing）。目前市场占有率最高的是 Illumina 公司的平台。
原理：边合成边测序（Sequencing by Synthesis, SBS）¶
白话解释：
- 每次往 DNA 链上加入一个带荧光标记的碱基
- 加完后用激光照射，相机拍照记录荧光颜色 → 知道加的是 A/T/G/C 中的哪个
- 去掉荧光标记，再加下一个碱基
- 重复这个过程几百个循环 → 就读出了几百个碱基的序列
白话比方：就像一台自动打字机，每打一个字就拍一张照片记录下来，打了 150 个字就有了一篇 150 个字的文章。不过这台打字机牛的地方是——它同时有几亿台在一起打字，所以一次能产出海量数据。
关键步骤（建库 + 测序）¶
原始 DNA
↓ ① 打断（Fragmentation）：把长 DNA 随机打碎成 200-500bp 的短片段
↓ ② 末端修复 + 加 A 尾（End Repair + A-tailing）：修整断口，为接头连接做准备
↓ ③ 接头连接（Adapter Ligation）：在片段两端接上特定序列（adapter），
| 就像给每个片段贴上"身份标签"，让测序仪能识别
↓ ④ PCR 扩增（可选）：把文库分子复制多份，增加信号强度
↓ ⑤ 上机测序：文库加载到 Flow Cell 上
↓ ⑥ 桥式 PCR（Bridge Amplification）：
| 片段在 Flow Cell 表面"搭桥"弯曲并扩增，
| 每个片段形成一个 cluster（簇），一个簇就是同一条序列的上千份拷贝
↓ ⑦ SBS 测序：逐碱基加入荧光核苷酸，每轮拍照记录
↓ ⑧ 数据输出：BCL 格式 → 转换为 FASTQ 格式
优缺点¶
| 方面 | 说明 |
|---|---|
| 优点 | 通量极高（一次跑出几十 Gb 到几 Tb 数据）；单碱基成本很低；准确率高（>99.9%，Q30>85%） |
| 缺点 | 读长短（通常 PE150，即每端 150bp）；对 GC 含量极端区域有偏好性（GC bias）；需要 PCR 扩增会引入偏差 |
常见平台对比¶
| 平台 | 定位 | 单次数据量 | 读长 | 典型应用 |
|---|---|---|---|---|
| MiSeq | 小型/快速 | 最高 ~15 Gb | 最长 2×300bp | 16S 扩增子测序、小基因组、临床快检 |
| NextSeq 2000 | 中型 | 最高 ~120 Gb（P3 flow cell） | 2×150bp | 转录组、外显子组、中等规模宏基因组 |
| NovaSeq X | 旗舰/大型 | 最高 ~16 Tb（双 25B flow cell） | 2×150bp | 大规模全基因组、大队列宏基因组 |
输出数据格式：FASTQ¶
FASTQ 文件是测序数据的标准格式，每条 read（一段测序读出的序列）占 4 行：
@DRR021375.1 1 length=100 ← 第1行：序列ID（@开头）
ATCGATCGATCGATCG... ← 第2行：碱基序列（ATCG组成）
+ ← 第3行：分隔符（固定是+号）
IIIIIIIIIIIIIIIII... ← 第4行：质量值（每个字符对应一个碱基的质量分数）
质量值用 ASCII 码表示，比如 I 对应 Q40（错误率 0.01%），5 对应 Q20（错误率 1%）。
4. 三代测序¶
三代测序的核心突破：能读很长的片段（几千到几百万碱基），而且不需要 PCR 扩增。
PacBio（SMRT 测序）¶
SMRT = Single Molecule, Real-Time（单分子实时测序）
- 原理：
- 白话解释：在一个极小的纳米孔洞（ZMW，Zero-Mode Waveguide，零模波导孔——你只需要知道它是一个极其微小的"观察孔"，小到只有一个聚合酶能在里面干活）底部固定一个 DNA 聚合酶（Polymerase，就是负责复制 DNA 的"工人"）
- 聚合酶一边合成 DNA，一边掺入带荧光的碱基
- 每掺入一个碱基就会闪一下特定颜色的荧光
- 底部的检测器实时记录荧光信号 → 直接读出序列
-
DNA 模板做成环形（SMRTbell——就是把 DNA 两端用接头连成环状，聚合酶可以绕圈反复读同一段 DNA），聚合酶可以绕环反复读，多次读取同一条序列取共识（consensus），大幅提高准确率
-
优缺点：
- 优点：
- 读长长（HiFi 模式平均 10-25 kb，最长可达 >100 kb）
- HiFi 模式准确率高（>99.9%，Q30+），已经接近 Illumina
- 能检测碱基修饰（如甲基化，不需要额外处理）
- 不需要 PCR，无扩增偏差
-
缺点：
- 通量相对 Illumina 低
- 设备和试剂成本高
- 对 DNA 样本质量要求高（需要高分子量 DNA）
-
适用场景：
- 基因组组装（assembly）：长读长能跨越重复区域
- 全长转录组（Iso-Seq）：直接读出完整 mRNA
- 表观遗传学：检测甲基化修饰
- 复杂基因组（高重复区域、多倍体植物基因组）
Oxford Nanopore（纳米孔测序）¶
- 原理：
- 白话解释：在一层膜上嵌入蛋白质纳米孔（直径约 1-2nm），膜两侧加电压产生电流
- DNA/RNA 单链在马达蛋白（Motor Protein）的驱动下，一个碱基一个碱基地穿过纳米孔
- 不同的碱基经过纳米孔时会产生不同的电流变化（"电流波形"）
- 算法根据电流变化模式反推出碱基序列
-
简单比方：就像不同形状的珠子穿过一个小洞，每种珠子堵住洞的程度不同，导致水流变化不同——通过测量水流变化就能判断是哪种珠子
-
优缺点：
- 优点：
- 读长理论上无上限（记录最长超过 4 Mb）
- 设备便携（MinION 只有 U 盘大小，几千元即可入门）
- 实时出数据，适合现场快速检测（如疫情监测、野外生态调查）
- 能直接测 RNA（不需要反转录）
- 能检测碱基修饰（甲基化等）
-
缺点：
- 原始读取准确率较低（最新 R10.4.1 芯片 + 最新 basecaller 可达 ~99% 单读准确率，但仍低于 Illumina 和 PacBio HiFi）
- 系统性错误（尤其是 homopolymer 连续相同碱基区域，如 AAAAAAA）
- 通量取决于设备型号差异较大
-
适用场景：
- 现场/便携式测序（传染病暴发、食品安全检测）
- 超长读长基因组组装
- 实时病原体鉴定
- 直接 RNA 测序
- 宏基因组中长读长辅助组装
5. 三种测序技术对比¶
| 特性 | Illumina（二代） | PacBio HiFi（三代） | Nanopore（三代） |
|---|---|---|---|
| 读长 | 短（75-300 bp） | 长（10-25 kb） | 超长（可达 Mb 级） |
| 单读准确率 | 高（>99.9%，Q30+） | 高（>99.9%，Q30+） | 中高（~99%，持续改进中） |
| 通量 | 极高（Tb 级） | 中等（几十 Gb） | 中（MinION ~10-50 Gb，PromethION ~100 Gb/flow cell，总通量可达 Tb 级） |
| 单碱基成本 | 最低 | 中等 | 低-中等 |
| 设备成本 | 高（几十万-几百万） | 高（几百万） | 低入门（MinION ~$1000） |
| PCR 扩增 | 需要 | 不需要 | 不需要 |
| 碱基修饰检测 | 不能（需额外实验） | 能（直接检测） | 能（直接检测） |
| 样本质量要求 | 中等 | 高（需高分子量 DNA） | 中-高 |
| 运行时间 | 1-3 天 | 小时-天 | 实时输出，分钟级开始 |
| 主要弱点 | 读长短，GC 偏差 | 成本高，通量受限 | 准确率较低，homopolymer 错误 |
| 最适合 | 大规模短读长项目：宏基因组、转录组、变异检测 | 高质量基因组组装、全长转录组 | 现场快检、超长读长组装、实时监测 |
面试要点：不要死记数字，重点理解"各有所长，互补使用"。现在很多大项目会 Illumina + PacBio/Nanopore 联合使用——用长读长搭骨架，用短读长纠错和补细节。
6. 建库流程（Library Preparation）¶
什么是建库¶
建库（Library Preparation，简称 lib prep）就是把生物样本中的 DNA/RNA 处理成测序仪能识别的形式。白话说：测序仪不能直接读你的 DNA 原液，你得按照测序仪的规矩把 DNA "包装"好才行，这个包装过程就是建库。
建库的基本步骤¶
- 提取核酸：从样本（血液、粪便、土壤等）中把 DNA/RNA 抽出来
- 打断（Fragmentation）：把长 DNA 切成合适大小的片段
- 物理法：超声波打断（Covaris 仪器）
- 酶切法：转座酶切割（如 Illumina 的 Nextera 方法，快速但有偏好性）
- 末端修复 + 加 A 尾：把碎片的断口修整齐，在 3' 端加一个 A 碱基
- 接头连接（Adapter Ligation）：在片段两端连上接头序列
- 接头包含：测序引物结合位点（让测序反应能启动）+ index 序列（样本标签，用于多样本混合测序后的数据拆分）
- PCR 扩增（可选）：把文库分子复制多份，增加上机量
- 质控：检查文库浓度、片段大小分布
- 上机测序
不同实验目的的建库差异¶
| 实验类型 | DNA/RNA | 特殊步骤 | 说明 |
|---|---|---|---|
| 全基因组测序（WGS） | DNA | 无特殊步骤 | 直接打断建库，覆盖全基因组 |
| 转录组测序（RNA-Seq） | RNA→cDNA | mRNA 富集（polyA 选择）或 rRNA 去除 | 先提 RNA，反转录成 cDNA 再建库 |
| 宏基因组测序 | DNA | 注意不要引入人源 DNA 污染 | 提取样本中所有微生物的 DNA 混在一起建库 |
| 16S 扩增子 | DNA | PCR 扩增 16S rRNA 基因的特定区域（V3-V4等） | 只测一个标记基因，不是全基因组 |
| ChIP-Seq | DNA | 免疫沉淀富集特定蛋白结合的 DNA | 研究蛋白-DNA 互作 |
7. 测序数据质量¶
Q20、Q30 是什么意思¶
Q 值（Quality Score，质量分数）是衡量每个碱基测序准确率的指标，用 Phred 公式计算：
Q = -10 × log₁₀(P)
其中 P 是该碱基测错的概率
不需要记公式，只需记住：Q 值每增加 10，错误率就降低 10 倍。
| Q 值 | 错误率 | 准确率 | 白话说 |
|---|---|---|---|
| Q10 | 10%（1/10） | 90% | 每 10 个碱基测错 1 个，质量很差 |
| Q20 | 1%（1/100） | 99% | 每 100 个碱基测错 1 个，基本及格线 |
| Q30 | 0.1%（1/1000） | 99.9% | 每 1000 个碱基测错 1 个，高质量 |
| Q40 | 0.01%（1/10000） | 99.99% | 每 10000 个碱基测错 1 个，非常高质量 |
面试高频考点：
- Illumina 测序一般要求 Q30 > 80-85% 才算合格
- 你的项目里 fastp 清洗标准就是 --qualified_quality_phred 20，即低于 Q20 的碱基算不合格
测序深度（Coverage）和测序量的关系¶
- 测序深度（Coverage / Sequencing Depth）= 总测序碱基数 ÷ 基因组大小
- 比如：人类基因组 ~3 Gb，测了 90 Gb 数据 → 深度 = 90/3 = 30×
- 白话说：基因组上的每个位置平均被测了 30 次
- 为什么要有深度：
- 测序有随机性，不是所有区域都均匀覆盖
- 深度越高，覆盖越全面，变异检测越准确
- 一般全基因组测序需要 30× 以上，外显子组需要 100× 以上
- 宏基因组的特殊情况：
- 宏基因组样本里有很多物种，丰度差异巨大
- 高丰度物种可能有 100× 覆盖，低丰度物种可能只有 0.1×
- 所以宏基因组需要较大的总测序量（通常 5-10 Gb/样本以上）
GC 含量偏差（GC Bias）¶
- 什么是 GC bias：Illumina 测序在 PCR 扩增和桥式扩增过程中，对 GC 含量极高（>70%）或极低（<30%）的区域扩增效率低，导致这些区域的测序深度不足。原因是：GC 碱基对有 3 个氢键、AT 只有 2 个，GC 高的区域更紧，PCR 时不容易解开
- 影响：某些微生物物种（如高 GC 的放线菌 Actinobacteria）可能在宏基因组数据中被低估
- 怎么判断：FastQC 报告中的"Per sequence GC content"模块会显示 GC 分布——正常应该是单峰正态分布，如果出现多峰说明可能有 GC 偏差或污染
8. 宏基因组测序（重点！和你的项目直接相关）¶
和普通基因组测序有什么区别¶
| 对比项 | 普通基因组测序 | 宏基因组测序 |
|---|---|---|
| 测序对象 | 单一物种的基因组 | 环境样本中所有微生物的基因组混合物 |
| DNA 来源 | 单一生物体 | 可能包含几百到几千个物种的 DNA 混在一起 |
| 数据复杂度 | 低（一个参考基因组） | 高（成百上千个基因组混在一起） |
| 分析目标 | 组装一个完整基因组、找变异 | 物种组成是什么、功能有哪些、不同样本间的差异 |
| 数据量需求 | 相对固定（30× 覆盖） | 需要很大数据量来覆盖低丰度物种 |
| 去宿主 | 通常不需要 | 必须做（如人粪便样本中可能有相当比例（10%-60% 甚至更高）是人源 DNA） |
16S rRNA 测序 vs 鸟枪法宏基因组测序¶
这是面试超高频考点！
| 对比项 | 16S rRNA 测序 | 鸟枪法宏基因组测序（Shotgun Metagenomics） |
|---|---|---|
| 测什么 | 只测 16S rRNA 基因（~1500bp）的一段（V3-V4 等可变区） | 测样本中所有 DNA 的随机片段 |
| 原理 | PCR 扩增特定基因 → 测序 → 比对数据库判断物种 | 直接打断总 DNA → 建库测序 → 比对数据库 |
| 分辨率 | 通常到属（genus）级别，种（species）级别不够准 | 可以到种甚至株（strain）级别 |
| 功能信息 | 没有（只知道"谁在那里"） | 有（知道"谁在那里"+"它们能干什么"） |
| 成本 | 低（每个样本几十-几百元） | 高（每个样本几百-几千元） |
| 数据量 | 小（几万-几十万条 reads/样本） | 大（几百万-几千万条 reads/样本） |
| PCR 偏差 | 有（不同物种的 16S 基因扩增效率不同） | 无/少（不依赖 PCR 扩增特定基因） |
| 适合场景 | 快速了解群落组成、大样本量调查 | 深入研究群落功能、发现新基因、高分辨率分析 |
白话总结： - 16S 测序就像在人群中只看每个人的身份证号 → 知道有谁，但不知道他们会什么技能 - 鸟枪法宏基因组测序就像把所有人的简历都复印碎了读一遍 → 知道有谁，也知道他们会什么
你的 T2D 项目用的是哪种¶
根据你的项目情况：
- 测序方式：鸟枪法宏基因组测序（Shotgun Metagenomics）
- 测序平台：Illumina（双端测序，Paired-End）
- 数据格式：双端 FASTQ（R1 + R2），gzip 压缩
- 分析流程：
- md5 校验数据完整性
- FastQC + MultiQC 质量评估
- fastp 质量控制（去接头、去低质量碱基、去短 reads）
- Bowtie2 + samtools 去宿主（去除人源 DNA）
- Kraken2 物种分类注释
- 多样性分析（Alpha + Beta diversity）
- 测序参数设置：
--qualified_quality_phred 20：Q20 为碱基质量阈值--length_required 50：最短 read 长度 50bp--detect_adapter_for_pe：自动检测双端接头
常用工具/命令¶
| 工具 | 用途 | 说明 |
|---|---|---|
FastQC |
质量评估 | 生成 HTML 报告，查看每条 read 的质量分布、GC 含量、接头残留等 |
MultiQC |
多样本汇总 | 把多个 FastQC 报告汇总成一个交互式网页 |
fastp |
数据清洗 | 去接头、去低质量碱基、过滤短 reads，速度快，一步到位 |
Trimmomatic |
数据清洗 | 老牌清洗工具，功能类似 fastp，但命令更复杂 |
Bowtie2 |
序列比对 | 短读长比对器，宏基因组中用于去宿主 |
BWA |
序列比对 | 另一个主流比对工具，常用于全基因组重测序 |
samtools |
BAM 处理 | 排序、过滤、索引 BAM 文件，配合比对工具使用 |
Kraken2 |
物种分类 | 基于 k-mer 的快速物种分类，宏基因组核心工具 |
Bracken |
丰度估计 | 配合 Kraken2 使用，校正物种丰度 |
seqkit |
FASTQ/FASTA 处理 | 统计序列数、长度、转换格式等瑞士军刀工具 |
实操代码/命令¶
查看 FASTQ 文件¶
# 查看压缩 FASTQ 文件的前 8 行（即前 2 条 reads）
# zcat：解压 .gz 文件并输出内容（不改变原文件）
# head -n 8：只看前 8 行
zcat project/data/raw_fastq/S01_R1.fastq.gz | head -n 8
# 输出示例（每条 read 占 4 行）：
# @DRR021375.1 1 length=100 ← 第1行：序列ID（@开头，包含 run 编号和 read 编号）
# ATCGATCGATCG... ← 第2行：碱基序列
# + ← 第3行：分隔符
# IIIIIIIIIII... ← 第4行：质量值（ASCII码，I=Q40，非常高质量）
统计 FASTQ 文件中的 reads 数量¶
# 方法1：数行数除以4（因为每条 read 占 4 行）
# zcat 解压 | wc -l 数行数
zcat project/data/raw_fastq/S01_R1.fastq.gz | wc -l
# 结果除以4就是reads数
# 方法2：用 seqkit 直接统计（更准确，推荐）
seqkit stats project/data/raw_fastq/S01_R1.fastq.gz
FastQC 质控¶
# 对原始 FASTQ 数据运行质量评估
# --outdir：指定输出目录
# 会生成 .html（人看的报告）和 .zip（程序读的数据包）
fastqc \
project/data/raw_fastq/S01_R1.fastq.gz \
project/data/raw_fastq/S01_R2.fastq.gz \
--outdir project/results/fastqc/
# 结果解读重点：
# 1. Per base sequence quality：每个位置的质量分布，绿色区域（>Q28）为好
# 2. Adapter Content：接头残留比例，应该接近 0%
# 3. Per sequence GC content：GC 分布应为单峰正态
fastp 数据清洗¶
# fastp 一步完成去接头 + 质量过滤 + 长度过滤
# --in1/--in2：双端输入文件（R1 和 R2）
# --out1/--out2：清洗后的输出文件
# --detect_adapter_for_pe：自动检测双端 adapter（不需要手动指定接头序列）
# --qualified_quality_phred 20：碱基质量低于 Q20（准确率 99%）标记为不合格
# --length_required 50：修剪后短于 50bp 的 read 整条丢弃
# --thread 4：使用 4 个线程加速
# --html/--json：生成可视化报告和可编程解析的 JSON 报告
fastp \
--in1 project/data/raw_fastq/S01_R1.fastq.gz \
--in2 project/data/raw_fastq/S01_R2.fastq.gz \
--out1 project/results/clean_fastq/S01_R1_clean.fastq.gz \
--out2 project/results/clean_fastq/S01_R2_clean.fastq.gz \
--detect_adapter_for_pe \
--qualified_quality_phred 20 \
--length_required 50 \
--thread 4 \
--html project/results/clean_fastq/S01_fastp_report.html \
--json project/results/clean_fastq/S01_fastp_report.json
# 判断清洗效果的三条标准：
# 1. Q30 > 90%（清洗后的数据高质量碱基占比要高）
# 2. Reads 损失 < 10%（不能丢太多数据）
# 3. 清洗后 FastQC 无新增 warning
MultiQC 汇总报告¶
# 把多个 FastQC 报告汇总成一个报告
# 指定 FastQC 结果目录，MultiQC 自动识别并汇总
multiqc project/results/fastqc/ \
-o project/results/multiqc/
和你项目的关联¶
你的 T2D（2型糖尿病）肠道菌群宏基因组项目中：
- 测序平台：Illumina 二代测序，双端测序（Paired-End）
- 数据来源：从 ENA 数据库下载的公开数据（study: PRJDB2953，run: DRR021375）
- 数据格式：双端 FASTQ（S01_R1.fastq.gz + S01_R2.fastq.gz）
- 质控步骤：
- md5 校验确认下载完整性（
md5sum -c） - FastQC 评估原始数据质量 → 报告无严重问题
- fastp 清洗（Q20 过滤 + 去接头 + 去短 reads）
- 清洗后再跑 FastQC 确认质量提升
- 后续流程：清洗后数据 → Bowtie2 去宿主 → Kraken2 物种分类 → 多样性分析
- 为什么选 Illumina + 鸟枪法：
- 需要同时知道物种组成和功能信息
- Illumina 通量高、成本低，适合大样本量的宏基因组研究
- 大部分已发表的肠道菌群-T2D 研究都用的这个方案，结果有可比性
面试怎么答¶
Q1: 简单介绍一下二代测序的原理¶
二代测序主要是 Illumina 的边合成边测序技术。简单说就是：先把 DNA 打碎建库，加到 Flow Cell 上通过桥式 PCR 扩增形成 cluster，然后每个循环加入一种带荧光标记的碱基，加上去之后用激光照、相机拍照记录颜色，这样一个循环读一个碱基，重复 150 个循环就能读出 150bp 的序列。它的核心优势是通量极高，一次能产出几 Tb 的数据，单碱基成本很低。
Q2: 二代和三代测序有什么区别？¶
最大的区别是读长。二代测序（如 Illumina）读长短，一般 150bp，但通量极高、准确率高、成本低。三代测序（如 PacBio 和 Nanopore）读长很长，PacBio HiFi 能读到 10-25kb，Nanopore 理论上没有上限。另外三代测序不需要 PCR 扩增，可以直接检测碱基修饰。但三代测序通量相对低，成本更高。实际项目中经常两者结合——用长读长搭骨架做组装，用短读长纠错补深度。我们的宏基因组项目用的是 Illumina，因为宏基因组主要需要高通量来覆盖大量微生物物种，Illumina 最合适。
Q3: 什么是 Q30？你怎么评估测序数据质量？¶
Q30 是 Phred 质量分数，表示一个碱基被测错的概率是千分之一，也就是 99.9% 的准确率。计算公式是 Q = -10 × log₁₀(P)，P 是错误概率。评估数据质量我主要看几个指标：第一是 Q30 占比，一般要求 85% 以上；第二是用 FastQC 看每个位置的碱基质量分布，看 3' 端有没有明显掉质量；第三是看接头残留比例；第四是 GC 含量分布是否正常。我在项目里用 fastp 做清洗，设置 Q20 作为过滤阈值，清洗后再跑 FastQC 确认 Q30 提升到 90% 以上。
Q4: 16S 测序和宏基因组测序有什么区别？¶
16S 测序是用特异性引物 PCR 扩增细菌 16S rRNA 基因的可变区（通常是 V3-V4 区），然后测序，通过和数据库比对来鉴定物种。它的优点是成本低、操作简单，缺点是分辨率通常只到属级别，而且没有功能信息，只知道"有谁"不知道"能干什么"。鸟枪法宏基因组测序是直接把样本中所有 DNA 随机打碎测序，不需要 PCR 扩增特定基因，分辨率可以到种甚至株级别，而且因为测的是全部基因，可以做功能注释，知道代谢通路信息。我的 T2D 项目用的是鸟枪法宏基因组，因为不仅要看菌群组成，还想分析和糖尿病相关的代谢功能。
Q5: 你的项目中测序数据是怎么处理的？¶
我的项目数据是从 ENA 数据库下载的 Illumina 双端宏基因组测序数据。拿到数据后先做 md5 校验确认下载完整。然后用 FastQC 评估原始数据质量，看碱基质量分布、接头残留、GC 含量这些指标。接着用 fastp 做数据清洗，设定 Q20 质量阈值、最短 50bp 长度过滤、自动去接头。清洗后再跑一次 FastQC 确认数据质量提升，Q30 要达到 90% 以上，reads 损失控制在 10% 以内。然后用 Bowtie2 比对人类参考基因组去除宿主 DNA，用 samtools 提取未比对的 reads 作为微生物 reads。最后用 Kraken2 做物种分类注释，生成分类报告和丰度表。整个流程用 Shell 脚本串起来，每一步都有日志记录和输出文件检查。
延伸阅读¶
-
Illumina 测序原理入门（官方中文）：Illumina 官方提供的 NGS for Beginners 教程，有动画演示 SBS 过程
→ https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/beginners.html -
StatQuest 测序原理视频（YouTube，英文带字幕，讲解非常直观）：Josh Starmer 的 Illumina/PacBio/Nanopore 原理动画讲解系列
→ 搜索 "StatQuest Illumina sequencing" 或 "StatQuest RNA-seq" -
《宏基因组学方法与应用》知乎专栏/微信公众号：中文社区总结的宏基因组分析教程和最新技术进展
→ 搜索"宏基因组"公众号或知乎专栏
最后更新：2026-05-02 | 编写说明：本文档专为彭文强面试准备编写，所有内容围绕宏基因组方向生信工程师岗位，命令参数与项目实际使用一致。