宏基因组全流程（Metagenomics Pipeline）¶

一句话概述¶

宏基因组分析从原始测序数据（raw sequencing data）出发，经过 数据校验 → 质量评估 → 质量控制 → 去宿主 → 物种注释 → 功能注释 → 多样性分析 的完整流程，最终实现对环境样本中微生物群落组成和功能的全面解析。

目录¶

• 1. 核心知识点（流程总览表）
• 2. 各步骤详解
• 2.1 md5校验
• 2.2 质量评估
• 2.3 质量控制/清洗
• 2.4 去宿主
• 2.5 物种注释
• 2.6 功能注释
• 2.7 多样性分析
• 3. 实战命令/代码（完整流程）
• 4. 面试常问点
• 5. 易错/易混淆点
• 6. 补充知识

1. 核心知识点（流程总览表）¶

2. 各步骤详解¶

2.1 md5校验（Data Integrity Check）¶

什么是md5？

md5（Message Digest Algorithm 5）是一种哈希算法，可以为任意大小的文件生成一个固定长度的128位（32个十六进制字符）"指纹"。即使文件只改变1个字节，md5值也会完全不同。

为什么要做md5校验？

• 测序数据通常由测序公司通过网络传输，过程中可能出现数据损坏
• 测序数据文件往往很大（几GB到几十GB），传输中断或磁盘错误的概率不低
• 如果数据损坏却不知道，后续分析结果都不可靠

实际操作：

测序公司交付数据时会同时提供一个 md5.txt 文件，里面记录了每个fastq.gz文件对应的md5值。我们下载数据后，重新计算md5值并与之比较，一致则说明数据完整。

2.2 质量评估（Quality Assessment）¶

FastQC 报告的核心模块：

MultiQC 的作用：

当样本很多时（比如实习中做几十个样本的宏基因组），逐一看FastQC报告太麻烦。MultiQC 能把所有样本的FastQC报告汇总成一个交互式网页，方便横向比较。

关键质量指标阈值：

2.3 质量控制/清洗（Quality Control）¶

fastp 是什么？

fastp 是一个高效的fastq文件预处理工具，可以同时完成质量过滤、接头去除、低质量碱基修剪等操作。相比老牌工具 Trimmomatic，fastp 速度更快（C++实现）、使用更简单，且自带HTML质量报告。

fastp 核心参数详解：

常见Illumina接头序列：

TruSeq Adapter (Read 1): AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA
TruSeq Adapter (Read 2): AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT
Nextera Adapter:          CTGTCTCTTATACACATCT

reads保留率参考标准：

2.4 去宿主（Host Removal）¶

为什么要去宿主？

宏基因组测序的对象是环境中的微生物DNA，但在样本采集和提取过程中，不可避免地会混入宿主（如人体肠道样本中的人源DNA）的序列。

不去宿主的后果： 1. 浪费计算资源：人源reads可能占10-50%甚至更高，这些reads参与后续分析纯属浪费 2. 干扰物种注释：人源序列可能被错误注释为微生物，产生假阳性 3. 影响丰度估计：分母（总reads数）被人源序列稀释，微生物丰度被低估 4. 功能注释污染：人类基因功能被混入微生物功能分析中

使用什么参考基因组？

• 人源宿主：GRCh38（hg38），即人类参考基因组第38版
• 下载地址：NCBI（GCA_000001405.15）或 UCSC（hg38.fa.gz）
• 小鼠样本：GRCm39（mm39）
• 其他动物样本：对应物种的参考基因组

Bowtie2 去宿主的原理：

1. 先用 bowtie2-build 对宿主参考基因组建立索引（只需做一次）
2. 将质控后的reads比对到宿主基因组
3. 提取未比对上的reads（即非宿主、属于微生物的reads）
4. 用 samtools 从BAM文件中提取未比对的reads

关键概念：samtools flag 过滤

对于PE数据，我们用 samtools view -b -f 12 提取双端都没比对上宿主基因组的read对。

Bowtie2 比对模式：

去宿主时推荐 --very-sensitive，因为我们希望尽可能多地识别和去除宿主序列，宁可多去一些也不要漏掉。

2.5 物种注释（Taxonomic Profiling）¶

Kraken2¶

原理：

Kraken2 使用精确的 k-mer 匹配算法进行物种分类。它将每条read切割成连续的 k-mer（默认k=35），然后在预建的数据库中查找每个k-mer属于哪个物种。最终通过LCA（Lowest Common Ancestor，最低公共祖先）算法确定read的分类。

数据库类型：

confidence 参数详解：

--confidence 参数控制分类的严格程度，取值范围 0-1。

• 含义：一条read被分类到某个物种时，支持该分类的k-mer比例必须 >= confidence值
• 默认值：0（不过滤，所有能分类的read都保留分类结果）

实际选择建议： - 常规分析：--confidence 0.05 或 --confidence 0.1 - 0.05 保留更多信息，适合探索性分析 - 0.2 更保守，适合需要高精度的发表级分析 - 具体选择还取决于数据库大小和样本类型

Bracken¶

为什么需要Bracken？

Kraken2 的分类结果存在一个问题：很多reads只能被分类到较高的分类层级（如属level），而不是种level。这是因为不同物种之间共享大量k-mer，Kraken2通过LCA算法会把这些reads推到它们的共同祖先节点。

Bracken（Bayesian Reestimation of Abundance with KrakEN）通过贝叶斯算法，将这些高层级的reads重新分配到种level，从而得到更准确的物种水平丰度估计。

Bracken 关键参数：

分类层级代码：

2.6 功能注释（Functional Annotation）¶

为什么要做功能注释？

物种注释告诉我们"有哪些微生物"，功能注释则告诉我们"这些微生物在做什么"。功能注释将基因序列映射到已知的功能数据库，揭示微生物群落的代谢潜力。

HUMAnN3¶

HUMAnN3（The HMP Unified Metabolic Analysis Network 3）是宏基因组功能注释的主流工具。

工作流程： 1. 先用MetaPhlAn进行物种鉴定 2. 根据鉴定结果选择对应的泛基因组数据库 3. 用Bowtie2将reads比对到泛基因组 4. 未比对上的reads用DIAMOND比对到UniRef蛋白数据库 5. 整合结果，输出通路丰度和基因家族丰度

主要输出：

eggNOG-mapper¶

eggNOG-mapper 通过将基因序列比对到eggNOG数据库，提供多种功能注释： - COG/KOG 分类：蛋白功能正交分类 - GO (Gene Ontology)：基因本体注释 - KEGG pathway：代谢通路注释 - CAZy：碳水化合物活性酶

HUMAnN3 vs eggNOG-mapper：

2.7 多样性分析（Diversity Analysis）¶

Alpha多样性（Alpha Diversity）¶

Alpha多样性衡量的是单个样本内部的物种多样性。

常用指标：

通俗解释Shannon指数：

想象一个花园： - 花园A：100朵花，分别是50朵玫瑰、30朵百合、20朵菊花 → Shannon较高 - 花园B：100朵花，95朵玫瑰、3朵百合、2朵菊花 → Shannon较低 - Shannon指数同时考虑了"有多少种花"（丰富度）和"每种花的数量是否均衡"（均匀度）

Beta多样性（Beta Diversity）¶

Beta多样性衡量的是不同样本之间的物种组成差异。

常用距离/相异度指标：

常用可视化方法：

统计检验：