宏基因组全流程 — 面试与复习¶

核心知识点速查表¶

4. 面试常问点¶

★ 宏基因组分析的基本流程是什么？¶

参考答案（结合实习经历）：

在生信公司实习期间，我参与了多个宏基因组项目的分析。基本流程如下：

首先是数据校验，用md5sum验证下机数据的完整性；然后用FastQC和MultiQC做质量评估，查看碱基质量、GC含量、接头残留等指标；接着用fastp做质量控制，去除接头序列和低质量reads；之后用Bowtie2将clean reads比对到人类参考基因组GRCh38进行去宿主，用samtools提取未比对上的微生物reads；再用Kraken2做物种分类注释，配合Bracken进行种水平丰度重估计；如果需要功能注释，会用HUMAnN3分析代谢通路；最后是多样性分析，包括Alpha多样性（Shannon、Simpson指数等）和Beta多样性（Bray-Curtis距离、PCoA等）。

在个人项目中，我还独立搭建了一个肠道宏基因组分析流程，从FastQC到多样性分析全流程自动化，通过shell脚本串联各个步骤。

★ 为什么要去宿主？不去会怎样？¶

参考答案：

去宿主是宏基因组分析中非常关键的一步。宏基因组测序的目标是微生物DNA，但样本采集时不可避免会混入宿主DNA，比如人肠道样本中可能含有10-50%的人源序列。

如果不去宿主，会造成几个问题： 1. 浪费计算资源：大量人源reads参与后续分析，既耗时又无意义 2. 干扰物种注释：人源序列可能被Kraken2错误地分类为微生物，产生假阳性结果 3. 影响丰度估计：分母（总reads数）被人源序列稀释，导致微生物真实丰度被低估 4. 功能注释污染：人类基因的功能信息混入微生物功能分析

我们一般用Bowtie2的 --very-sensitive 模式将reads比对到人类参考基因组GRCh38，然后用samtools提取双端都没比对上的reads对（flag 12），这些就是微生物reads。选择very-sensitive模式是因为去宿主时我们宁可多去一些也不要漏掉。

★ Kraken2的confidence参数怎么选？0.05和0.2有什么区别？¶

参考答案：

Kraken2的 --confidence 参数控制物种分类的严格程度，取值范围0到1。它的含义是：一条read被分类到某个物种时，支持该分类的k-mer比例必须达到这个阈值。

0.05（常用推荐值）：比较宽松，只要有5%以上的k-mer支持就接受分类。这样做的好处是灵敏度高，能检测到更多低丰度物种，但可能有一些假阳性。适合探索性分析和常规宏基因组分析。

0.2（较严格）：需要20%以上的k-mer支持，大幅减少假阳性，但会丢失一些低丰度物种或与近缘物种k-mer共享较多的species。适合需要高精度的发表级分析。

实际选择时要根据项目需求：如果是初步探索、想尽可能全面地了解群落组成，用0.05；如果是准备发文章、需要高可信度，可以用0.1或0.2。在生信公司的项目中，我们一般用0.05作为默认值，如果客户对假阳性敏感会适当提高。

需要注意的是，调高confidence不会改善Kraken2数据库本身的局限性，比如数据库中没有的物种无论confidence设多少都检测不到。

★ fastp的主要质控参数有哪些？你怎么设置的？¶

参考答案：

fastp是我们做宏基因组质控的主要工具，主要参数和该常用设置如下：

1. 接头去除：开启 --detect_adapter_for_pe 自动检测PE数据接头，也可以用 --adapter_sequence 手动指定Illumina TruSeq接头序列

2. 碱基质量过滤：--qualified_quality_phred 20 表示质量值低于Q20的碱基被视为不合格（Q20对应1%的错误率）；--unqualified_percent_limit 40 表示一条read中不合格碱基超过40%就整条丢弃

3. 长度过滤：--length_required 50，处理后短于50bp的read丢弃，因为太短的read比对效率低且容易产生假阳性

4. 滑窗修剪：--cut_front 和 --cut_tail 开启首尾滑窗修剪，配合 --cut_window_size 4 和 --cut_mean_quality 20，在读取的5'端和3'端用4bp滑窗检测，平均质量低于20就切掉

5. N碱基过滤：--n_base_limit 5，含N碱基超过5个的read丢弃

6. 碱基纠错：--correction 利用PE reads重叠区域进行碱基校正

一般经过这些参数处理后，reads保留率在90%以上就算正常。fastp还自带HTML报告，可以直观看到质控前后的效果对比。

★ 如何判断测序数据质量好不好？（FastQC报告解读）¶

参考答案：

拿到FastQC报告后，我会重点关注以下几个模块：

1. Per base sequence quality（最重要）：看每个位置的碱基质量分布箱线图。正常情况下Q值应该在20以上，Q30以上的碱基占比应该超过85%。如果3'端质量急剧下降，说明需要做trimming

2. Adapter content：看接头残留情况。如果曲线明显上升，说明有接头污染，质控时需要去接头

3. Per sequence GC content：看GC含量分布是否接近正态分布。如果出现多峰或严重偏移，可能有其他物种DNA污染

4. Sequence length distribution：正常的原始数据应该集中在固定长度（如150bp）。如果分布不均一可能有问题

5. Overrepresented sequences：如果有大量高频重复序列，可能是接头残留或rRNA污染

6. Per base sequence content：前几个位置ATCG比例有波动是正常的（random primer导致），但后面应该趋于稳定

总体判断标准：Q20>95%、Q30>85%、接头含量<5%、GC分布正常、无大量重复序列，就认为数据质量是好的。如果是多个样本，我会用MultiQC汇总查看，方便横向比较发现异常样本。

★ reads保留率多少算正常？¶

参考答案：

reads保留率需要分两个阶段看：

1. fastp质控后：正常保留率应该在90%以上。如果低于85%，说明原始数据质量较差，可能测序出了问题，需要跟测序公司沟通。保留率过低也可能是质控参数设置过严导致的

2. 去宿主后：这个取决于样本类型。人肠道样本一般保留70-99%，因为采样部位和方法不同，人源DNA含量差异很大（粪便样本人源含量通常较低，活检组织样本人源含量高）。土壤、水体等环境样本去宿主后保留率通常>95%，因为基本没有宿主DNA

在实际工作中，如果fastp后保留率低于85%或去宿主后保留率异常低（如人肠道样本低于50%），我会回头检查原始数据质量或参数设置，必要时联系测序公司确认是否需要重测。

★ 宏基因组和16S扩增子的区别？¶

参考答案：

这是两种不同的微生物群落研究方法，主要区别如下：

对比维度	宏基因组（Metagenomics）	16S扩增子（16S Amplicon）
测序对象	样本中所有DNA（全基因组）	仅16S rRNA基因的特定区域（如V3-V4）
信息量	基因组+功能信息	仅物种分类信息
分辨率	可达种甚至菌株水平	通常到属水平，种水平不太可靠
功能分析	可以做（HUMAnN3等）	只能做预测（PICRUSt2，不够准确）
成本	较高（需要大量测序数据）	较低（测序量小）
分析复杂度	较高（计算资源需求大）	较低（分析流程相对简单）
覆盖范围	细菌、古菌、真菌、病毒等	主要是细菌和古菌（16S基因特异）
偏好性	偏好小（直接测全基因组）	受引物偏好影响（不同引物扩增效率不同）
常用工具	Kraken2, HUMAnN3, MEGAHIT等	QIIME2, DADA2, mothur等
常见数据量	每样本5-20G	每样本5-10万条reads

简单总结：16S像是"人口普查"——知道有哪些微生物；宏基因组像是"全面调查"——不仅知道有谁，还知道它们在做什么。

在生信公司实习时，两种方法的项目我都做过。16S项目主要是用QIIME2做OTU聚类和多样性分析；宏基因组项目流程更复杂，但获得的信息更丰富。客户预算有限时推荐16S，需要功能信息或高分辨率分类时推荐宏基因组。

★ Kraken2和MetaPhlAn的区别？（加分题）¶

参考答案：

对比	Kraken2	MetaPhlAn
原理	k-mer精确匹配	clade-specific marker gene比对
数据库	全基因组（RefSeq）	标记基因
速度	非常快	较慢
内存需求	较大（标准库约70GB）	较小（几GB）
灵敏度	高（但假阳性较多）	较低（但精确度高）
丰度估计	需配合Bracken	自带丰度估计
适用场景	快速筛查、大规模样本	精确定量、小样本深入分析

★ 组装（Assembly）在宏基因组中的作用是什么？（加分题）¶

参考答案：

宏基因组分析有两条路线： 1. 基于reads的分析（read-based）：直接用reads做物种注释和功能注释，如Kraken2、HUMAnN3 2. 基于组装的分析（assembly-based）：先将reads拼接成更长的contigs，再做基因预测和注释

组装常用工具如 MEGAHIT 或 metaSPAdes，组装后可以用 Prodigal 做基因预测，再用 eggNOG-mapper 或 DIAMOND 做功能注释。

组装的优势：得到更完整的基因序列，功能注释更准确；可以做binning（分箱）获得MAGs（Metagenome-Assembled Genomes），即直接从宏基因组数据中恢复单个微生物的基因组。

组装的劣势：低丰度物种可能组装不出来；嵌合体contigs（chimeric contigs）问题；计算资源需求大。

5. 易错/易混淆点¶

⚠️ 1. Kraken2和Bracken的区别¶

易混淆点： 初学者常把两者混为一谈，或者只用Kraken2不用Bracken。

正确理解： - Kraken2 是分类器（classifier）：将每条read分配到一个分类单元，但很多reads只能到属甚至更高层级 - Bracken 是丰度估计器（abundance estimator）：在Kraken2结果基础上，用贝叶斯算法把高层级reads重新分配到种水平 - 两者是配合使用的关系：先Kraken2分类，再Bracken估计丰度 - 如果只用Kraken2，种水平的丰度会严重低估（因为大量reads停留在属及以上层级）

⚠️ 2. 去宿主前后reads数变化的解读¶

易错点： 看到去宿主后reads大幅减少就认为"数据不好"。

正确理解： - 人肠道样本的宿主比例变异很大（5-50%），粪便样本通常人源含量较低，但活检或灌洗液样本可能很高 - 去宿主后reads减少不一定是坏事，反而说明成功去除了大量人源污染 - 需要关注的是去宿主后剩余的微生物reads数量是否足够做后续分析（通常需要至少几百万条） - 如果去宿主后保留率极低（如<30%），才需要考虑是否采样有问题

⚠️ 3. fastp的--qualified_quality_phred含义¶

易混淆点： 误以为 --qualified_quality_phred 20 表示"所有低于Q20的碱基都直接去掉"。

正确理解： - 这个参数定义的是"什么叫不合格碱基"的阈值，低于Q20的碱基被标记为不合格 - 但仅仅标记为不合格不会直接丢弃，还要看 --unqualified_percent_limit - 只有当一条read中不合格碱基的比例超过了 --unqualified_percent_limit（默认40%），这条read才会被丢弃 - 真正负责"切掉低质量碱基"的是 --cut_front、--cut_tail 等滑窗参数 - 理解三者关系：qualified_quality_phred 定义"什么是低质量"；unqualified_percent_limit 决定"低质量碱基太多时丢弃整条read"；cut_front/cut_tail 负责"修剪掉末端的低质量区域"

⚠️ 4. 数据库版本不一致的影响¶

易错点： 不同样本或不同时间的分析使用了不同版本的数据库（如Kraken2标准库），然后把结果直接合并比较。

正确理解： - 数据库更新会增加或修改物种分类信息，不同版本数据库的注释结果不具有直接可比性 - 同一批项目的所有样本必须使用完全相同版本的数据库 - 建议在项目开始时记录数据库版本和下载日期 - 发表文章时必须注明使用的数据库版本（如 "Kraken2 standard database, 2023-06-05 release"） - 如果需要重分析历史数据，应该用新数据库对所有样本重新分析，而不是只分析新样本

⚠️ 5. SE和PE数据处理差异¶

易混淆点： 用PE数据的参数和命令直接处理SE数据，或者反过来。

正确理解： - PE（Paired-End）：一条DNA片段从两端分别测序，产生R1和R2两个文件 - SE（Single-End）：只从一端测序，产生一个文件 - fastp处理SE数据不需要 -I/-O 参数和 --detect_adapter_for_pe - Bowtie2处理SE数据用 -U 参数而不是 -1/-2 - samtools提取未比对reads时，SE数据用 -f 4 而不是 -f 12 - Kraken2处理SE数据不需要 --paired 参数 - 宏基因组分析绝大多数情况是PE数据，SE在宏基因组中很少用

⚠️ 6. 比对率 ≠ 分类率¶

易混淆点： 混淆 Bowtie2 的比对率和 Kraken2 的分类率。

正确理解： - Bowtie2比对率：reads比对到宿主参考基因组的比例 → 这个越高，说明宿主污染越严重 - Kraken2分类率：reads被成功分类到物种的比例 → 这个越高，说明数据库覆盖越好 - 两者完全不同的概念，不要混淆 - Kraken2分类率通常在50-80%，有20-50%的reads无法分类是正常的（数据库不可能覆盖所有微生物）

⚠️ 7. --confidence 不等于准确率¶

易混淆点： 以为设置 --confidence 0.95 就能保证95%的准确率。

正确理解： - confidence 是指支持某分类的k-mer占该read所有k-mer的比例阈值 - 它是一个过滤标准，不是准确率的保证 - 设太高（如0.5以上）会导致大量reads变为"未分类"，可能丢失有价值的信息 - 准确率还受数据库质量、物种相似度等因素影响 - 选择合适的confidence需要在灵敏度和精确度之间权衡

⚠️ 8. 多样性分析中丰度表的标准化¶

易混淆点： 直接用原始reads计数做多样性分析，不做标准化。

正确理解： - 不同样本的测序深度（总reads数）可能差异很大 - 不做标准化，测序深度高的样本会天然显示更高的物种丰富度 - Alpha多样性分析前通常需要做稀释（rarefaction）或标准化 - Beta多样性分析中，Bray-Curtis距离自带相对丰度标准化，但最好还是先将计数转为相对丰度 - 不同的标准化方法（rarefaction、TSS、CSS、TMM等）可能导致不同结果，需要根据具体情况选择

6. 补充知识¶

6.1 常见文件格式¶

6.2 质量值（Phred Quality Score）换算¶

计算公式：Q = -10 * log10(P)，其中P是错误概率

6.3 常用Linux命令速查¶

# 查看fastq文件的reads数（每4行一条read）
zcat sample.fq.gz | wc -l | awk '{print $1/4}'

# 查看fastq文件前几条reads
zcat sample.fq.gz | head -12   # 查看前3条reads（每条4行）

# 统计文件大小
du -sh *.fq.gz

# 后台运行并记录日志
nohup bash pipeline.sh > pipeline.log 2>&1 &

# 查看后台任务
jobs -l

# 查看磁盘空间（分析前确认空间足够）
df -h

# 统计某个物种在Kraken2 report中的丰度
grep "Escherichia coli" sample_kraken2.report

6.4 分析流程时间和资源参考¶

注意：Kraken2标准数据库需要大量内存（约70GB），这是宏基因组分析中对服务器配置要求最高的步骤之一。内存不足时可以使用MiniKraken数据库（约8GB）。

快速复习卡片¶

流程口诀：
校（md5校验）→ 评（FastQC评估）→ 控（fastp质控）→ 去（Bowtie2去宿主）→ 分（Kraken2分类）→ 功（功能注释）→ 多（多样性分析）

关键数字：
- Q20 > 95%, Q30 > 85%
- fastp保留率 > 90%
- Kraken2 confidence: 0.05（常规）/ 0.2（严格）
- 去宿主用 --very-sensitive
- samtools -f 12（PE双端未比对）
- Bracken -r 150 -l S -t 10

🔄 最新版本动态（2026年4月更新）¶

📌 面试加分：提到Kraken2最新版v2.17.0和PrackenDB，说明你关注工具更新。Standard-8数据库只需8GB内存，适合内存有限的服务器。

最后更新：2026-04-27 适用岗位：生物信息分析工程师 关联知识库：02_微生物多样性分析.md、03_功能注释数据库.md