CNVkit — 高通量测序拷贝数变异检测工具¶

# 方法1：conda安装（推荐，v0.9.13）
conda create -n cnvkit python=3.10   # CNVkit需要Python 3.10+
conda activate cnvkit

conda config --add channels defaults
conda config --add channels bioconda
conda config --add channels conda-forge
conda install cnvkit                  # 安装最新版（0.9.13，2026年更新）

# 验证安装
cnvkit.py version    # 查看版本号
cnvkit.py --help     # 查看所有子命令

# 安装可选依赖（R包，用于绘图）
conda install -c conda-forge r-base r-ggplot2 r-dnacopy  # R的CBS分割算法

# WES数据：有配对正常样本（最常用场景）
cnvkit.py batch \
    tumor.bam \                        # 肿瘤样本BAM
    --normal normal.bam \              # 配对正常样本BAM
    --targets targets.bed \            # 捕获区域BED文件（WES专用）
    --annotate refFlat.txt \           # 基因注释（用于自动获取antitarget区域）
    --fasta reference.fasta \          # 参考基因组
    --output-reference reference_flat.cnn \  # 输出参考样本CNN文件
    --output-dir cnvkit_output \       # 输出目录
    -p 16                              # 线程数

# WGS数据：无靶向捕获区域
cnvkit.py batch \
    tumor.bam \
    --normal normal.bam \
    --method wgs \                     # 全基因组模式（不需要--targets）
    --fasta reference.fasta \
    --output-dir cnvkit_wgs_out \
    -p 16

# 步骤1：计算目标区域覆盖度（肿瘤和正常样本）
cnvkit.py coverage tumor.bam targets.bed -o tumor.targetcoverage.cnn   # 目标区域
cnvkit.py coverage tumor.bam antitargets.bed -o tumor.antitargetcoverage.cnn  # 非目标区域

cnvkit.py coverage normal.bam targets.bed -o normal.targetcoverage.cnn
cnvkit.py coverage normal.bam antitargets.bed -o normal.antitargetcoverage.cnn

# 步骤2：构建参考基线（从正常样本）
cnvkit.py reference normal.targetcoverage.cnn normal.antitargetcoverage.cnn \
    --fasta reference.fasta -o reference_flat.cnn

# 步骤3：归一化（肿瘤相对参考）
cnvkit.py fix \
    tumor.targetcoverage.cnn \
    tumor.antitargetcoverage.cnn \
    reference_flat.cnn \
    -o tumor.cnr                      # 比率文件（log2 ratio）

# 步骤4：片段化分割（CBS算法）
cnvkit.py segment tumor.cnr -o tumor.cns  # 分割结果文件

# 步骤5：可视化
cnvkit.py scatter tumor.cnr -s tumor.cns -o tumor_scatter.pdf  # 散点图
cnvkit.py diagram tumor.cnr -s tumor.cns -o tumor_diagram.pdf  # 染色体图

# 完整WES体细胞CNV分析

REF="hg38.fasta"
TARGETS="agilent_sureselect_v6.bed"    # 捕获区域

# 1. 一键批处理（推荐）
cnvkit.py batch \
    tumor.bam \
    --normal normal.bam \
    --targets $TARGETS \
    --fasta $REF \
    --annotate refFlat.txt \
    --output-reference reference.cnn \
    --output-dir cnv_results \
    -p 20

# 2. 查看结果文件
ls cnv_results/
# tumor.targetcoverage.cnn    - 目标区覆盖度
# tumor.antitargetcoverage.cnn - 非目标区覆盖度
# tumor.cnr                   - 每个bin的log2 ratio
# tumor.cns                   - 分割后的CNV段

# 3. 调用绝对拷贝数（需要肿瘤纯度信息）
cnvkit.py call \
    cnv_results/tumor.cns \
    --purity 0.75 \             # 肿瘤纯度75%
    --ploidy 2 \
    -o tumor_absolute.cns

# 4. 导出基因级别结果
cnvkit.py export seg tumor.cns -o tumor.seg  # SEG格式（IGV等工具可用）
cnvkit.py genemetrics cnv_results/tumor.cnr \
    -s cnv_results/tumor.cns \
    -t 0.4 \                    # 阈值过滤微小变化
    -o gene_level_cnv.txt       # 每个基因的CNV统计

# 5. 可视化全基因组CNV图
cnvkit.py scatter cnv_results/tumor.cnr \
    -s cnv_results/tumor.cns \
    -o cnv_scatter.pdf

# 6. 查看扩增/缺失基因
awk '$5 > 2' gene_level_cnv.txt | head  # 查看高扩增基因（>2倍log2 ratio）
awk '$5 < -2' gene_level_cnv.txt | head # 查看深度缺失基因