代谢组学基础与数据分析（Metabolomics）¶

DNA（基因组）→ mRNA（转录组）→ 蛋白质（蛋白质组）→ 代谢物（代谢组）
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         上游（信息层）  ──────────────────→  下游（功能层）

你的研究问题是什么？
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├── 需要快速、无损、高重复性的代谢指纹  → NMR
│
├── 需要尽可能多地检测代谢物（非靶向发现）→ LC-MS（首选）
│
├── 需要检测SCFA/挥发性有机物/脂肪酸  → GC-MS
│
└── 高通量临床大队列  → NMR（标准化好）或 LC-MS（灵敏度高）

原始数据（.raw/.mzML/.mzXML）
    │
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[Step 1] 峰提取/特征检测（Feature Detection）
    │   - 从连续信号中找到离散的"峰"
    │   - 每个峰 = 一个潜在代谢物特征（m/z + 保留时间 RT）
    ▼
[Step 2] 峰对齐（Alignment）
    │   - 校正不同样品间保留时间的漂移
    │   - 确保同一代谢物在所有样品中对应同一行
    ▼
[Step 3] 峰填充/缺失值处理（Gap Filling）
    │   - 补回因噪声被遗漏的峰
    │   - 最小值/KNN/随机森林填充
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[Step 4] 标准化/归一化（Normalization）
    │   - 去除系统偏差（样品量差异、仪器漂移等）
    │   - 常用方法：总峰面积归一化、中位数归一化、
    │     内标归一化、PQN、LOESS信号校正
    ▼
[Step 5] 数据转换（Transformation）
    │   - Log转换：减少数据偏度
    │   - Pareto scaling：除以标准差的平方根
    │   - Auto scaling：标准化到均值0、方差1
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[Step 6] 多元统计分析（Multivariate Analysis）
    │   ├── PCA（主成分分析）— 无监督，看整体分布和离群样品
    │   ├── PLS-DA（偏最小二乘判别分析）— 有监督，找组间差异方向
    │   └── OPLS-DA（正交PLS-DA）— 去除组内变异，更聚焦组间差异
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[Step 7] 差异代谢物筛选
    │   - 标准：VIP > 1（PLS-DA中变量重要性）
    │           + p-value < 0.05（t检验/Mann-Whitney U）
    │           + Fold Change > 1.5 或 < 0.67
    │   - 火山图（Volcano Plot）可视化
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[Step 8] 代谢物鉴定（Identification）
    │   - Level 1：与标准品比对（RT + MS/MS一致）
    │   - Level 2：与数据库谱图匹配（HMDB/METLIN/MassBank）
    │   - Level 3：仅基于精确质量推测分子式
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[Step 9] 通路分析（Pathway Analysis）
    │   - 富集分析：差异代谢物是否集中在某条通路
    │   - 拓扑分析：考虑代谢物在通路网络中的位置重要性
    │   - 常用数据库：KEGG、MetaCyc、Reactome
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[结果解读] 生物学意义 → 实验验证

白话：把几千维的数据压缩到2-3维画在纸上
      如果两组样品自然分开了，说明代谢谱确实有差异

作用：
- 质控（QC样品是否聚在一起？）
- 发现批次效应
- 观察组间趋势

注意：PCA是无监督的，分不开不代表没差异（可能差异在更多维度上）

白话：跟PCA的区别是"我告诉算法哪个是疾病组、哪个是对照组"
      算法就专门找能区分两组的方向

关键指标：
- R²X：模型对X（代谢物数据）的解释度
- R²Y：模型对Y（分组标签）的解释度
- Q²：交叉验证的预测能力（Q² > 0.5 通常认为模型可靠）
- VIP值：每个变量对分组的贡献度（VIP > 1 认为重要）

验证方法：
- 置换检验（Permutation test, n=200次）
- 如果R²和Q²都显著高于随机模型，模型才可信

# 安装XCMS（Bioconductor包）
# BiocManager::install("xcms")

library(xcms)  # 加载XCMS包

# 1. 读入原始数据（.mzML格式）
raw_data <- readMSData(
  files = list.files("data/", pattern = ".mzML", full.names = TRUE),  # 读取所有mzML文件
  mode = "onDisk"  # 不全部载入内存，节省RAM
)

# 2. 峰提取（CentWave算法）
cwp <- CentWaveParam(
  peakwidth = c(5, 30),  # 峰宽范围（秒）：代谢物峰通常5-30秒
  ppm = 10,              # 质量偏差容许范围（百万分之十）
  snthresh = 5           # 信噪比阈值：信号需 ≥ 5倍噪声
)
xdata <- findChromPeaks(raw_data, param = cwp)  # 执行峰提取

# 3. 峰对齐（OBI-Warp算法）
xdata <- adjustRtime(xdata, param = ObiwarpParam())  # 保留时间校正

# 4. 峰分组（对应不同样品中相同代谢物）
pdp <- PeakDensityParam(
  sampleGroups = sampleData(xdata)$group,  # 样品分组信息
  bw = 5,               # 峰密度估计带宽
  minFraction = 0.5     # 至少50%样品中要检测到这个峰
)
xdata <- groupChromPeaks(xdata, param = pdp)  # 执行分组

# 5. 缺失值填充
xdata <- fillChromPeaks(xdata)  # 回到原始数据中补回缺失峰

# 6. 导出特征矩阵
feature_table <- featureValues(xdata, value = "into")  # 峰面积矩阵
# 行 = 特征（m/z_RT），列 = 样品

1. 上传数据（CSV格式：行=样品，列=代谢物，第一列=分组标签）
2. 数据过滤 → 缺失值处理 → 归一化 → 转换 → 缩放
3. 统计分析：PCA、PLS-DA、热图、火山图
4. 富集分析：选择物种 → 选择通路库 → 运行
5. 通路分析：同时考虑富集和拓扑重要性
6. 下载报告（PDF + CSV）

白话：把所有MS/MS谱图按相似度"连线"，相似的谱图连在一起形成"网络"
      同一族的化合物（如不同的胆汁酸）会聚成一个小团

核心概念：
- Cosine Score（余弦相似度）：两张谱图有多像，>0.7认为相关
- 分子网络图（Molecular Network）：节点=代谢物，边=谱图相似
- 类比：社交网络中，朋友圈相似的人容易被归为同一社群

KEGG通路图就像一张"代谢地铁图"：
- 车站 = 代谢物（化合物）
- 地铁线路 = 代谢通路
- 换乘站 = 参与多条通路的关键代谢物

你的差异代谢物如果集中在某条"线路"上，说明这条通路被疾病影响了。

常见代谢通路举例：
- 糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）
- TCA循环（Citrate Cycle）
- 氨基酸代谢（各种氨基酸的合成和降解）
- 脂肪酸代谢（β-氧化等）
- 胆汁酸合成（Bile acid biosynthesis）
- 色氨酸代谢（Tryptophan metabolism）

膳食纤维 → 肠道菌群发酵 → SCFA（乙酸60%、丙酸25%、丁酸15%）

SCFA的保护机制：
1. 丁酸 → 肠上皮细胞的主要能量来源 → 维护肠屏障完整
2. 丙酸 → 肝脏糖异生底物 → 调节血糖
3. 乙酸/丙酸 → 激活GPR41/GPR43受体 → 促进GLP-1分泌 → 改善胰岛素敏感性
4. SCFA → 抑制NF-κB → 减少炎症因子

T2D中：产SCFA的菌（Faecalibacterium prausnitzii等）减少 
       → SCFA产量下降 → 肠屏障受损 → LPS入血 → 慢性低度炎症 → 胰岛素抵抗