CARD — 综合抗生素耐药数据库使用指南¶

# 安装 RGI（Resistance Gene Identifier）— CARD 配套命令行工具
conda create -n rgi python=3.10 -y
conda activate rgi

# 从 bioconda 安装 RGI（当前版本 v6.0.3）
conda install -c bioconda -c conda-forge rgi -y

# 验证安装
rgi --version             # 查看版本

# 下载 CARD 数据库（必须步骤）
# 从 CARD 官网下载最新数据库
wget https://card.mcmaster.ca/latest/data \
    -O card_data.tar.bz2          # 下载最新 CARD 数据包

# 解压
tar -xjf card_data.tar.bz2        # 解压得到 card.json

# 加载数据库到 RGI
rgi load --card_json card.json \
    --local                        # 加载到当前目录

# 验证数据库加载
rgi database --version            # 显示当前数据库版本

# 分析蛋白质序列（速度最快，最常用）
# --input_sequence：输入序列文件
# --output_file：输出文件前缀
# --input_type：序列类型（protein/contig/read）
# --alignment_tool：比对工具（BLAST/DIAMOND）
rgi main \
    --input_sequence prokka_out/sample.faa \
    --output_file rgi_results/sample \
    --input_type protein \
    --alignment_tool DIAMOND \
    --local \                     # 使用本地数据库
    --num_threads 16 \
    --clean                       # 清理临时文件

# 直接分析宏基因组 reads（无需预先组装）
# rgi bwt：基于 Bowtie2/BWA 的宏基因组 reads 比对模式
rgi bwt \
    --read_one sample_R1.fq.gz \
    --read_two sample_R2.fq.gz \
    --output_file bwt_results/sample \
    --aligner bowtie2 \           # 比对工具（bowtie2/bwa）
    --threads 16 \
    --local \
    --clean

# 批量分析多个 MAG 的蛋白质文件
mkdir -p rgi_results

for faa in bakta_annotations/*/*.faa; do
    name=$(basename $(dirname $faa))       # 提取 MAG 名
    rgi main \
        --input_sequence $faa \
        --output_file rgi_results/${name} \
        --input_type protein \
        --alignment_tool DIAMOND \
        --local \
        --num_threads 8 \
        --clean
    echo "[完成] ${name}"
done

# RGI 输出多个文件
ls rgi_results/sample*
# sample.txt     — 制表符分隔主结果（最常用）
# sample.json    — JSON 格式完整结果
# sample.fasta   — 命中序列

# 主结果文件 sample.txt 重要列
# ORF_ID         — 查询序列 ID
# Model_Name     — CARD 数据库模型名（如 TEM-1 beta-lactamase）
# ARO            — CARD 本体编号
# Drug Class     — 抗生素类别
# Resistance Mechanism — 耐药机制
# AMR Gene Family — AMR 基因家族
# Best_Hit_Bitscore — 比对 bitscore
# Best_Identities — 序列同一性（%）
# Cut_Off        — 置信度（Strict/Perfect/Loose）

# 筛选高置信度结果（Strict 或 Perfect）
awk -F'\t' '$16=="Strict" || $16=="Perfect"' rgi_results/sample.txt \
    > rgi_results/sample_hq.txt    # 高质量 AMR 命中结果

# 场景：比较健康人和 T2D 患者肠道菌群的 AMR 基因丰度

# 1. 分析每个样本的宏基因组（reads 模式）
mkdir -p card_bwt_results

for sample in HC_01 HC_02 T2D_01 T2D_02; do
    rgi bwt \
        --read_one reads/${sample}_R1.fq.gz \
        --read_two reads/${sample}_R2.fq.gz \
        --output_file card_bwt_results/${sample} \
        --aligner bowtie2 \
        --threads 16 \
        --local \
        --clean
done

# 2. 汇总 AMR 基因频率（从 gene_mapping.txt 提取）
for f in card_bwt_results/*.gene_mapping.txt; do
    sample=$(basename $f .gene_mapping.txt)
    echo "样本 ${sample} 的 AMR 命中数: $(wc -l < $f)"
done

# 3. 可视化（Python 简单热图）
python3 -c "
import pandas as pd
# 加载多个样本结果汇总成矩阵
# 可用 RGI heatmap 子命令
"

# 或使用 RGI 自带热图工具
rgi heatmap \
    --input rgi_results/ \         # 包含多个结果的目录
    --category drug_class \        # 按抗生素类别分组
    --display fill \               # 填充模式
    --output amr_heatmap.png       # 输出图片

# 数据库下载与加载
wget https://card.mcmaster.ca/latest/data -O card.tar.bz2
tar -xjf card.tar.bz2 && rgi load --card_json card.json --local

# 蛋白质序列分析
rgi main -i sample.faa -o results/sample -t protein --alignment_tool DIAMOND --local -n 16 --clean

# 宏基因组 reads 分析
rgi bwt -1 R1.fq.gz -2 R2.fq.gz -o results/sample --aligner bowtie2 --threads 16 --local --clean

# 查看 CARD 数据库统计
rgi database --version