46. 泛基因组分析（Pan-genome Analysis）¶

一句话说明：泛基因组是一个物种所有个体基因组的总和集合，通过分析哪些基因是共有的、哪些是特有的，揭示物种内部的遗传多样性全貌。

1. 什么是泛基因组（Pan-genome）¶

白话解释¶

想象一个班级拍集体照——单张照片（传统参考基因组）只能拍到站在前排的人，而泛基因组就像把全班每个人的照片都拍一遍再合在一起，这样就不会漏掉任何一个人的特征。

正式定义¶

泛基因组（Pan-genome）指一个物种（或一个群体）中所有个体的基因组序列的总集合。它包括： - 所有个体共享的序列 - 部分个体拥有的序列 - 某个个体独有的序列

概念起源¶

• 2005年，Tettelin 等人在研究 B 群链球菌时首次提出 "pan-genome" 概念
• 最初用于微生物基因组学（因为细菌基因组小、个体差异大）
• 后来扩展到植物基因组（水稻、小麦等作物）和人类基因组

2. 核心概念：Core / Accessory / Unique¶

泛基因组按照基因在群体中的分布频率，分为三个层次：

更细分的划分（微生物常用）¶

Shell genes：在 15%-95% 的菌株中出现（中等频率）
Cloud genes：在 <15% 的菌株中出现（低频率）
Soft-core：在 95%-99% 的菌株中出现（接近核心但非100%）

生物学意义¶

3. 人类泛基因组参考（T2T-CHM13 / HPRC）最新进展¶

3.1 T2T-CHM13：第一个完整人类基因组¶

背景问题：传统人类参考基因组 GRCh38 仍有约 8% 的序列是 gap（空缺），主要集中在着丝粒、端粒和重复序列区域。

T2T-CHM13 成果（2022年 Science 发表）： - 全名：Telomere-to-Telomere（端粒到端粒） - 首次实现人类基因组从一端到另一端的完整无缺口组装 - 使用 CHM13（完全性葡萄胎细胞系，近乎纯合） - 新增约 2 亿 bp 序列（之前 GRCh38 中缺失的区域） - 补全了所有 22 条常染色体 + X 染色体的着丝粒序列 - 发现了约 2,000 个新基因（大部分是 rRNA 基因拷贝）

3.2 HPRC：人类泛基因组参考联盟¶

全称：Human Pangenome Reference Consortium

目标：构建一个能代表全球人类遗传多样性的泛基因组参考

Release 1（2023年5月，Nature 发表）： - 47 个遗传多样性个体的双倍体、分相组装（phased diploid assemblies） - 共 94 条单倍型（haplotype） - 覆盖每个基因组 >99% 的预期序列 - 结构和碱基水平准确率 >99% - 相比 GRCh38 新增 1.19 亿 bp 常染色质多态序列 - 新增 1,115 个基因重复 - 约 9,000 万 bp 来自结构变异 - 使用泛基因组分析短读长数据：小变异发现错误减少 34%，结构变异检测数量增加 104%

Release 2（2025年春季）： - 超过 200 个样本（>400 条单倍型） - 使用更先进的组装算法（整合 HiFi + ONT + Hi-C） - 更连续、结构更准确的组装 - 增加了碱基级别 polish 步骤，SNP 和 indel 错误减少一半以上 - 新增 HiFi 转录组数据用于基因注释

Release 3（2026年夏季，计划中）： - 超过 350 个组装（>700 条单倍型） - 纳入国际合作伙伴数据（International Human Pangenome Project） - 目标：每条单倍型实现端粒到端粒（T2T）级别的完整组装

4. 微生物泛基因组分析工具¶

4.1 Roary（经典工具）¶

定位：快速大规模原核生物泛基因组分析流水线

特点： - 输入：GFF3 格式的基因注释文件（通常由 Prokka 生成） - 速度：128 个样本 < 1 小时（1 GB RAM，单核） - 核心算法：CD-HIT 聚类 + BLAST 比对 + MCL 聚类

安装（conda）：

# 创建环境并安装 Roary
conda install -c bioconda roary

基本用法：

# 输入：prokka 注释后的 GFF 文件
# -p：线程数  -e -n：用 MAFFT 做核心基因比对  -f：输出目录
roary -p 8 -e -n -f roary_output *.gff

# 关键参数：
# -i 95    ：blastp 最低相似度阈值（默认95%）
# -cd 99   ：基因在多少比例的菌株中出现才算 core（默认99%）

输出文件： | 文件 | 内容 | |------|------| | gene_presence_absence.csv | 基因在每个样本中的有无矩阵 | | core_gene_alignment.aln | 核心基因的多序列比对 | | summary_statistics.txt | Core/Shell/Cloud 基因数量统计 | | pan_genome_reference.fa | 泛基因组代表序列 |

注意：Roary 已停止维护（最新 release 2019年），建议新项目使用 Panaroo。

4.2 Panaroo（推荐工具）¶

定位：Roary 的改进版，更准确的泛基因组分析

核心改进： - 使用图（graph）结构建模基因家族关系 - 能纠正基因注释错误（annotation errors） - 减少假阳性和假阴性 - 支持多种聚类严格度模式

安装：

# conda 安装（推荐）
conda install -c bioconda panaroo

# 或 pip 安装
pip install panaroo

基本用法：

# --clean-mode: strict（严格）/moderate（中等）/sensitive（敏感）
# -a core：输出核心基因比对
panaroo -i *.gff -o panaroo_output \
    --clean-mode strict \
    -a core \
    -t 8

# QC检查（推荐先运行）
panaroo-qc -i *.gff -o qc_output -t 8

Roary vs Panaroo 对比：

5. 泛基因组图（Pan-genome Graph）¶

概念解释¶

白话：传统参考基因组像一条单行道，所有人的 reads 都要映射到同一条路上；泛基因组图则像一张城市地图，有主路（参考路径）也有各种岔路（变异路径），每个人可以走不同的路线。

正式定义：泛基因组图是一种用图数据结构（节点 + 边 + 路径）表示多个基因组序列的方法，其中： - 节点（Node）：DNA 序列片段 - 边（Edge）：节点之间的连接关系 - 路径（Path）：一个个体基因组在图中的走法

为什么需要图？¶

传统线性参考基因组的问题： 1. 参考偏差（Reference bias）：与参考不同的 reads 更难比对上去 2. 丢失多样性：一条线性序列无法同时表示多个等位基因 3. 结构变异盲区：大的插入/缺失/倒位很难用线性坐标描述

泛基因组图的优势： 1. 同时编码多个单倍型 2. 减少比对偏差 3. 天然支持结构变异表示

5.1 vg（variation graph）¶

定位：变异图的全套工具集——构建、比对、基因分型、变异检测

GitHub Stars：1,300+（最活跃的泛基因组图工具）

核心功能： | 子命令 | 功能 | |--------|------| | vg construct | 从 VCF + FASTA 构建图 | | vg autoindex | 自动构建各类索引 | | vg giraffe | 快速短读长比对（推荐） | | vg map | 通用读长比对 | | vg call | 变异检测 | | vg deconstruct | 从图中提取 VCF | | vg surject | 图比对转换为 BAM |

HPRC 图的使用：

# 下载 HPRC 预构建的人类泛基因组图（GBZ格式）
# GBZ 是高度压缩格式，支持单倍型路径

# 使用 vg giraffe 进行快速比对
vg giraffe -Z hprc-v1.1-mc-grch38.gbz \
    -f reads_1.fq.gz -f reads_2.fq.gz \
    -o BAM > aligned.bam

图格式说明： | 格式 | 特点 | |------|------| | GFA | 文本格式，通用交换格式 | | VG (.vg) | vg 原生格式，支持编辑 | | GBZ (.gbz) | 高度压缩，适合大量单倍型路径 |

5.2 Minigraph（李恒开发）¶

定位：序列到图的比对器 + 图构建器

核心思路：增量式构图——以参考基因组为骨架，逐个添加新组装的序列差异

特点： - 由 minimap2 作者李恒（Heng Li）开发 - 专注于结构变异级别的图构建（不处理 SNP） - 速度极快：90 个人类组装 → 几天（24核） - 输出 rGFA 格式

安装与使用：

# 安装
git clone https://github.com/lh3/minigraph
cd minigraph && make

# 增量构图：以参考为骨架，逐步加入新样本
# -cxggs：构图模式
minigraph -cxggs -t16 ref.fa sample1.fa sample2.fa > pangenome.gfa

# 对单个样本调用结构变异
minigraph -cxasm --call pangenome.gfa sample.fa > sample.bed

# 提取所有气泡（bubble = 结构变异）
gfatools bubble pangenome.gfa > sv.bed

Minigraph-Cactus： - Minigraph + Cactus 的组合流水线 - 用于 HPRC 官方泛基因组图构建 - 能生成碱基级精确比对的全基因组图

vg vs Minigraph 对比¶

6. 泛基因组分析流程¶

6.1 微生物泛基因组标准流程¶

原始测序数据
    ↓ 质控（fastp/Trimmomatic）
    ↓ 组装（SPAdes/MEGAHIT）
基因组组装
    ↓ 基因注释（Prokka）
GFF3 注释文件
    ↓ 泛基因组分析（Panaroo/Roary）
    ↓
├── Core 基因比对 → 系统发育树（RAxML/IQ-TREE）
├── 基因有无矩阵 → 关联分析（Scoary）
└── 泛基因组曲线 → 开放/封闭判断

6.2 人类泛基因组分析流程¶

长读长测序（HiFi + ONT）+ Hi-C
    ↓ 组装（hifiasm + ONT 整合）
双倍体分相组装（diploid phased assembly）
    ↓ 质控（Merqury/QUAST）
高质量单倍型组装
    ↓ 图构建（Minigraph-Cactus）
泛基因组图（GFA/GBZ）
    ↓ 索引（vg autoindex）
    ↓
├── 短读长比对（vg giraffe）→ 变异检测（DeepVariant）
├── 结构变异检测（vg call / minigraph --call）
└── 群体遗传学分析

6.3 判断泛基因组是"开放"还是"封闭"¶

开放泛基因组（Open）：加入新样本时基因总数持续增长
    → 典型代表：大肠杆菌、铜绿假单胞菌
    → 含义：物种获取外源基因能力强（水平基因转移活跃）

封闭泛基因组（Closed）：加入新样本时基因总数趋于稳定
    → 典型代表：炭疽杆菌、结核分枝杆菌
    → 含义：物种基因组相对保守

7. 应用场景¶

7.1 精准医学¶

7.2 作物育种¶

7.3 微生物进化与公共卫生¶

8. 面试高频题（5道）¶

Q1：什么是泛基因组？和传统参考基因组有什么区别？¶

答题模板：

泛基因组是一个物种所有个体的基因组集合，包括 Core（所有个体共有）、Accessory（部分个体共有）和 Unique（个体特有）三部分。传统参考基因组只代表一个或少数个体，存在参考偏差问题——与参考不同的变异容易被遗漏。泛基因组通过同时表示多个个体的序列，解决了单一参考的局限性。以人类为例，HPRC 泛基因组相比 GRCh38 多了 1.19 亿 bp 的多态序列。

Q2：Core genome 和 Accessory genome 分别有什么生物学意义？¶

答题模板：

Core genome 包含物种生存的必需基因（管家基因），如 DNA 复制、转录翻译相关基因，进化上保守、突变率低。Accessory genome 包含环境适应相关基因，如抗生素耐药基因、毒力因子、代谢相关基因，它们使物种能适应不同的生态位。在微生物中，Accessory genes 常通过水平基因转移获得，是细菌快速适应环境的重要机制。

Q3：泛基因组图（Graph）比线性参考基因组有什么优势？¶

答题模板：

三个核心优势：(1) 减少参考偏差——图同时编码多个等位基因，与参考不同的 reads 也能准确比对；(2) 天然表示结构变异——插入、缺失、倒位在图中是不同路径，不需要额外编码；(3) 提高变异检测精度——HPRC 研究显示，使用泛基因组图分析短读长数据，小变异错误减少 34%，SV 检测增加 104%。代表工具有 vg（全功能分析）和 Minigraph（快速图构建）。

Q4：请比较 Roary 和 Panaroo 两个微生物泛基因组工具。¶

答题模板：

两者都是从 GFF 注释文件计算原核生物泛基因组的工具。Roary 是经典工具（2015年），速度快，128个样本不到1小时，但已停止维护。Panaroo（2020年）是改进版，核心改进在于使用图结构建模基因家族，能发现并纠正基因注释错误，减少假阳性/假阴性。对于新项目我推荐使用 Panaroo，它的 --clean-mode strict 模式能有效过滤注释噪声。两者输出格式兼容，都可以接入下游的 Scoary 关联分析和系统发育分析。

Q5：HPRC 人类泛基因组的最新进展是什么？¶

答题模板：

HPRC 第一版（2023年5月 Nature）发布了 47 个个体的双倍体分相组装（94条单倍型），覆盖率和准确率均 >99%。2025年春季发布 Release 2，扩展到 200+ 样本（400+ 单倍型），使用 HiFi+ONT+Hi-C 整合的更先进组装算法，新增转录组数据支持基因注释。2026年夏季计划发布 Release 3，目标 350+ 组装（700+ 单倍型），实现每条单倍型 T2T 级别的完整组装。技术上，使用 Minigraph-Cactus 构建泛基因组图，vg giraffe 做快速比对，整个生态系统正在走向临床应用成熟。

9. 速查表¶

工具速查¶

概念速查¶

关键数字速记¶

10. 延伸资源¶

必读论文¶

1. HPRC Draft Pangenome：Liao et al. "A draft human pangenome reference." Nature 617, 312-324 (2023). DOI: 10.1038/s41586-023-05896-x
2. T2T-CHM13：Nurk et al. "The complete sequence of a human genome." Science 376, 44-53 (2022). DOI: 10.1126/science.abj6987
3. Minigraph-Cactus：Hickey et al. "Pangenome graph construction from genome alignments with Minigraph-Cactus." Nature Biotechnology 42, 1031-1036 (2024).
4. Roary：Page et al. "Roary: rapid large-scale prokaryote pan genome analysis." Bioinformatics 31, 3691-3693 (2015).
5. Panaroo：Tonkin-Hill et al. "Producing polished prokaryotic pangenomes with the Panaroo pipeline." Genome Biology 21, 180 (2020).

在线资源¶

相关知识库文章¶

• 知识库1：基因组组装相关章节
• 知识库2：宏基因组分析流程（本知识库其他篇目）

小结¶

泛基因组分析正在从"前沿研究"走向"标准实践"： - 微生物领域：Panaroo 已成为标准流水线的一部分 - 人类基因组：HPRC 泛基因组图正在逐步替代 GRCh38 成为新的参考标准 - 面试重点：理解 Core/Accessory/Unique 的概念、图的优势、HPRC 最新进展

对于该宏基因组方向面试，泛基因组分析与该肠道菌群研究直接相关——当你有多个菌株的基因组时，泛基因组分析能帮助你理解菌株间的功能差异（哪些基因是共有的管家基因，哪些是某些菌株特有的适应性基因）。