空间转录组分析¶

传统 scRNA-seq：
  组织 → 消化打散 → 单个细胞 → 测序
  结果：知道每个细胞表达了什么基因
  丢失：细胞原来在组织里的位置
  白话：把拼图打散后数每块拼图的颜色，但不知道原来拼在哪里

空间转录组：
  组织切片 → 原位捕获/检测 → 带坐标的表达量
  结果：知道每个位置表达了什么基因
  保留：空间坐标信息
  白话：直接看拼好的拼图，每个位置的颜色和图案都清清楚楚

基于捕获的方法（Visium / Stereo-seq / Slide-seq）：
  组织切片放在带"分子邮编"的载玻片上
  → 每个位置有独特的 DNA 条形码（就像邮编）
  → mRNA 从细胞里释放出来，被对应位置的条形码捕获
  → 测序后根据条形码知道每条 mRNA 来自哪个位置
  白话：在地板上铺满带编号的胶纸，撒下来的彩珠粘在哪张纸上就记录那个编号

基于成像的方法（MERFISH）：
  用荧光探针直接在组织切片上标记目标 mRNA
  → 多轮杂交 + 拍照，用编码方案识别不同基因
  → 直接在图像上定位每条 mRNA 分子的坐标
  白话：用不同颜色的荧光笔在组织上直接给不同基因画标记，拍照后就知道哪里有什么

原始数据（FASTQ + 组织图像）
  │
  ▼
┌──────────────────────────────────┐
│ Step 1: Space Ranger（10x 官方工具）│  ← 比对、定量、spot 定位
│   spaceranger count               │
│   输入: FASTQ + 组织图像 + 参考基因组│
│   输出: filtered_feature_bc_matrix │
│          + spatial/ 文件夹         │
└──────────────┬───────────────────┘
               │
               ▼
┌──────────────────────────────────┐
│ Step 2: 加载数据到 Python/R       │  ← Scanpy/Squidpy 读取
│   scanpy.read_visium()            │
│   生成 AnnData 对象               │
│   .obs = spot 元信息              │
│   .obsm['spatial'] = 空间坐标     │
└──────────────┬───────────────────┘
               │
               ▼
┌──────────────────────────────────┐
│ Step 3: 质控与预处理              │  ← 同 scRNA-seq 流程
│   过滤低质量 spot                 │
│   归一化 + log 转换               │
│   高变基因筛选                    │
│   PCA 降维                       │
└──────────────┬───────────────────┘
               │
               ▼
┌──────────────────────────────────┐
│ Step 4: 空间可视化                │  ← Squidpy 核心功能
│   在组织图像上叠加基因表达热图     │
│   sq.pl.spatial_scatter()         │
└──────────────┬───────────────────┘
               │
               ▼
┌──────────────────────────────────┐
│ Step 5: 空间聚类                  │  ← 考虑空间邻域
│   构建空间邻接图                  │
│   sq.gr.spatial_neighbors()       │
│   Leiden/Louvain 聚类             │
└──────────────┬───────────────────┘
               │
               ▼
┌──────────────────────────────────┐
│ Step 6: 细胞类型反卷积            │  ← 推断 spot 内细胞组成
│   cell2location / RCTD / Tangram  │
│   需要 scRNA-seq 参考数据         │
└──────────────┬───────────────────┘
               │
               ▼
┌──────────────────────────────────┐
│ Step 7: 空间变异基因（SVG）        │  ← 发现空间特异基因
│   sq.gr.spatial_autocorr()        │
│   Moran's I / Geary's C 统计量   │
└──────────────┬───────────────────┘
               │
               ▼
┌──────────────────────────────────┐
│ Step 8: 细胞通讯分析              │  ← 空间配体-受体互作
│   CellChat / COMMOT / squidpy    │
│   sq.gr.ligrec()                  │
└──────────────────────────────────┘

# 创建专用 conda 环境
conda create -n spatial python=3.10 -y  # 创建名为 spatial 的环境
conda activate spatial                   # 激活环境

# 安装 squidpy（会自动安装 scanpy、anndata 等依赖）
pip install squidpy==1.8.1               # 安装 squidpy 最新稳定版

# 如果需要反卷积，额外安装 cell2location
pip install cell2location==0.1.5         # 安装 cell2location

import scanpy as sc           # 导入 scanpy，用于基础单细胞/空间分析
import squidpy as sq           # 导入 squidpy，用于空间特异性分析
import matplotlib.pyplot as plt  # 导入绑图库

# --- 方式1：加载 Squidpy 内置示例数据（学习用） ---
# Squidpy 自带多个空间转录组示例数据集
adata = sq.datasets.visium_hne_adata()  # 加载 Visium H&E 染色示例数据
# 返回的 adata 是 AnnData 对象，包含表达矩阵 + 空间坐标 + 组织图像

# --- 方式2：加载 Space Ranger 输出（实际项目用） ---
# adata = sc.read_visium(
#     path="path/to/spaceranger/outs",  # Space Ranger 输出目录
#     count_file="filtered_feature_bc_matrix.h5",  # 过滤后的表达矩阵
# )

# 查看数据结构
print(adata)                    # 打印 AnnData 基本信息
# AnnData object with n_obs × n_vars = 2688 × 18078
#   obs: spot 级别元信息（cluster 等）
#   var: 基因级别信息
#   obsm: 包含 'spatial' 键 → 每个 spot 的 (x, y) 坐标
#   uns: 包含 'spatial' 键 → 组织图像和缩放参数

print(adata.obsm['spatial'][:5])  # 查看前 5 个 spot 的空间坐标

# --- 基础质控（与 scRNA-seq 类似） ---
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, inplace=True)  # 计算质控指标
# 计算每个 spot 的总 counts 数、检测到的基因数等

# 过滤低质量 spot
sc.pp.filter_cells(adata, min_counts=500)   # 过滤总 counts < 500 的 spot
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=10)     # 过滤在少于 10 个 spot 中表达的基因

# --- 标准预处理流程 ---
sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4)  # 归一化：每个 spot 总 counts 统一到 10000
sc.pp.log1p(adata)                             # log 转换：log(x+1)，压缩数据范围
sc.pp.highly_variable_genes(adata, n_top_genes=2000)  # 筛选前 2000 个高变基因
# 高变基因 = 在不同 spot 间表达差异最大的基因，携带最多生物学信息

# PCA 降维
sc.pp.pca(adata, n_comps=50)  # 主成分分析，保留前 50 个主成分
# PCA 把 2000 维基因表达压缩到 50 维，保留主要信息

# 构建邻域图 + UMAP（用于可视化）
sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=15)  # 构建 KNN 图（K=15）
sc.tl.umap(adata)                       # UMAP 降维到 2D 用于可视化
sc.tl.leiden(adata, resolution=0.5)     # Leiden 聚类，resolution 控制聚类粗细

# --- 在组织图像上可视化聚类结果 ---
sq.pl.spatial_scatter(
    adata,
    color="leiden",          # 用 leiden 聚类结果着色
    shape=None,              # 不显示 spot 边框
    size=1.5,                # spot 大小
    img=True,                # 叠加组织 H&E 图像作为背景
    figsize=(8, 8),          # 图片尺寸
)
plt.title("Leiden Clustering on Tissue")  # 添加标题
plt.savefig("spatial_clusters.png", dpi=300, bbox_inches='tight')  # 保存高清图
plt.show()

# --- 可视化特定基因的空间表达 ---
# 示例：查看某个 marker 基因在组织上的表达分布
sq.pl.spatial_scatter(
    adata,
    color=["EPCAM", "VIM", "PTPRC"],  # 上皮/间质/免疫细胞 marker
    shape=None,
    size=1.5,
    img=True,
    cmap="Reds",             # 使用红色色阶（白 → 红）
    figsize=(18, 6),
    ncols=3,                 # 三个基因并排显示
)
plt.savefig("spatial_markers.png", dpi=300, bbox_inches='tight')
plt.show()

# --- 构建空间邻域关系 ---
# 这是 Squidpy 区别于普通 Scanpy 的核心：利用空间坐标构建邻域图
sq.gr.spatial_neighbors(
    adata,
    coord_type="generic",     # 坐标类型，Visium 用 "generic" 或 "grid"
    delaunay=True,            # 使用 Delaunay 三角剖分构建邻域
    # n_neighs=6,             # 或指定每个 spot 的邻居数量
)
# 结果存储在 adata.obsp['spatial_connectivities']（邻接矩阵）
# 和 adata.obsp['spatial_distances']（距离矩阵）

print("空间邻接矩阵:", adata.obsp['spatial_connectivities'].shape)
# 白话：记录了哪些 spot 是"邻居"关系——后续分析都基于这个邻域图

# --- 寻找空间变异基因（Spatially Variable Genes, SVG） ---
# 空间变异基因 = 在空间上有明显分布模式的基因（不是随机分布的）
sq.gr.spatial_autocorr(
    adata,
    mode="moran",             # 使用 Moran's I 统计量
    # mode="geary",           # 或使用 Geary's C
    n_perms=100,              # 置换检验次数（用于计算 p 值）
    n_jobs=4,                 # 并行线程数
)
# Moran's I 接近 +1 = 高度空间聚集（相似值扎堆）
# Moran's I 接近  0 = 随机分布
# Moran's I 接近 -1 = 空间分散（相似值远离）

# 查看结果（按 Moran's I 降序排列）
svg_results = adata.uns['moranI'].sort_values('I', ascending=False)
print(svg_results.head(10))  # 打印 top 10 空间变异基因

# 可视化 top 空间变异基因
top_svg = svg_results.index[:4].tolist()  # 取 top 4 SVG
sq.pl.spatial_scatter(
    adata,
    color=top_svg,
    shape=None, size=1.5, img=True,
    cmap="viridis",           # 使用 viridis 色阶
    figsize=(16, 4), ncols=4,
)
plt.savefig("top_svgs.png", dpi=300, bbox_inches='tight')
plt.show()

# --- 空间配体-受体互作分析 ---
# 分析空间上相邻的 spot/细胞之间的信号通讯
sq.gr.ligrec(
    adata,
    cluster_key="leiden",     # 基于 leiden 聚类结果
    n_perms=100,              # 置换检验次数
    use_raw=False,            # 使用预处理后的数据
)
# 结果存储在 adata.uns['leiden_ligrec']
# 包含每对配体-受体在每对 cluster 之间的统计显著性

# 可视化配体-受体互作结果
sq.pl.ligrec(
    adata,
    cluster_key="leiden",
    source_groups=["0", "1"],  # 信号发送方的 cluster
    target_groups=["2", "3"],  # 信号接收方的 cluster
    pvalue_threshold=0.01,     # 只显示 p < 0.01 的互作对
    figsize=(10, 6),
)
plt.savefig("ligrec_dotplot.png", dpi=300, bbox_inches='tight')
plt.show()

# --- 邻域富集分析 ---
# 检验某两种细胞类型（cluster）是否在空间上倾向于相邻
sq.gr.nhood_enrichment(
    adata,
    cluster_key="leiden",     # 基于 leiden 聚类
)
# 白话：检查不同 cluster 的 spot 是否"喜欢做邻居"
# z-score > 0 = 倾向于相邻（共定位）
# z-score < 0 = 倾向于远离（互斥）

# 可视化邻域富集热图
sq.pl.nhood_enrichment(
    adata,
    cluster_key="leiden",
    figsize=(6, 6),
)
plt.title("Neighborhood Enrichment (z-score)")  # 邻域富集 z 值热图
plt.savefig("nhood_enrichment.png", dpi=300, bbox_inches='tight')
plt.show()

白话类比：
  一杯混合果汁 → 推断里面有 40% 苹果汁 + 30% 橙汁 + 30% 葡萄汁
  一个 spot 的表达谱 → 推断里面有 50% 上皮细胞 + 30% 免疫细胞 + 20% 成纤维细胞

  需要"纯果汁样本"做参考 → 这就是 scRNA-seq 参考数据的作用

┌─────────────────────── 空间转录组分析速查 ───────────────────────┐
│                                                                │
│  技术平台选择：                                                  │
│    全转录组 + 易上手    → 10x Visium                             │
│    超高分辨率 + 大面积  → Stereo-seq                             │
│    亚细胞级 + 基于成像  → MERFISH                                │
│    全转录组 + 高分辨率  → Slide-seq / Visium HD                  │
│                                                                │
│  分析工具选择：                                                  │
│    Python 一站式       → Squidpy (v1.8.1)                      │
│    R 一站式            → Giotto (v4.0.0)                        │
│    数据加载/预处理      → Scanpy (v1.12.1)                      │
│    反卷积（Python）     → cell2location (v0.1.5)                │
│    反卷积（R）          → RCTD/spacexr                          │
│    scRNA-seq 映射      → Tangram (v1.0.4)                      │
│    细胞通讯            → CellChat / sq.gr.ligrec()              │
│    统一数据格式         → SpatialData (v0.7.2)                  │
│                                                                │
│  核心函数速查（Squidpy）：                                       │
│    sc.read_visium()              # 加载 Visium 数据             │
│    sq.gr.spatial_neighbors()     # 构建空间邻域图               │
│    sq.pl.spatial_scatter()       # 空间可视化                   │
│    sq.gr.spatial_autocorr()      # 空间变异基因（Moran's I）    │
│    sq.gr.nhood_enrichment()      # 邻域富集分析                 │
│    sq.gr.ligrec()                # 配体-受体互作                │
│    sq.gr.co_occurrence()         # 共现分析                     │
│    sq.im.process()               # 组织图像处理                 │
│                                                                │
│  关键统计量：                                                    │
│    Moran's I → 空间自相关（+1 聚集, 0 随机, -1 分散）          │
│    Geary's C → 空间自相关（0 聚集, 1 随机, >1 分散）           │
│    z-score   → 邻域富集（>0 共定位, <0 互斥）                   │
│                                                                │
│  反卷积方法选择：                                                │
│    精度优先   → cell2location（贝叶斯，计算慢）                 │
│    速度优先   → RCTD（统计方法，处理批次效应好）                 │
│    多功能     → Tangram（深度学习，可做映射）                    │
│                                                                │
│  空间转录组三要素：                                              │
│    1. 基因表达矩阵（哪些基因表达了，表达了多少）                │
│    2. 空间坐标（每个 spot/cell 在组织上的 x, y 位置）          │
│    3. 组织图像（H&E 染色，提供形态学上下文）                    │
│                                                                │
└────────────────────────────────────────────────────────────────┘