RagTag — 参考基因组引导的组装 Scaffolding 工具¶

一句话说明¶

RagTag 利用已有的参考基因组将你的组装 contig 排列成染色体级别的 scaffold，还能修补 gap 和修正错误组装，是小型实验室没有 Hi-C 数据时获得染色体级别组装的最佳替代方案。

安装与配置¶

# 方法1：conda 安装（推荐）
conda install -c bioconda ragtag  # 从 bioconda 安装

# 方法2：pip 安装
pip install ragtag

# 验证安装
ragtag.py --version  # 当前最新 2.1.0（2023年）

# 依赖工具（会自动安装）
# minimap2（比对）、unimap（可选替代比对器）

RagTag 三大功能¶

scaffold：用参考基因组排列 contig 顺序和方向
correct：修正错误组装（错误连接的 contig）
patch：用查询序列修补参考基因组的 gap

核心用法¶

Scaffolding（最常用）¶

# 用参考基因组引导 scaffolding
ragtag.py scaffold \
  reference.fa \                 # 参考基因组（近缘物种的高质量组装）
  query_assembly.fa \            # 你的组装结果（要被排列的 contig）
  -o ragtag_scaffold_output \    # 输出目录
  -t 16                          # 16 线程

# 主要输出文件
# ragtag_scaffold_output/ragtag.scaffold.fasta — scaffolding 后的序列
# ragtag_scaffold_output/ragtag.scaffold.agp — AGP 格式的排列信息

先修正再 scaffolding（推荐流程）¶

# 第1步：修正错误组装
ragtag.py correct \
  reference.fa \                 # 参考基因组
  query_assembly.fa \            # 你的组装
  -o ragtag_correct_output \     # 输出目录
  -t 16

# 第2步：用修正后的结果做 scaffolding
ragtag.py scaffold \
  reference.fa \
  ragtag_correct_output/ragtag.correct.fasta \  # 修正后的序列
  -o ragtag_scaffold_output \
  -t 16

进阶用法¶

# 修补参考基因组的 gap（用你的组装序列填充）
ragtag.py patch \
  reference_with_gaps.fa \       # 有 gap 的参考基因组
  query_assembly.fa \            # 你的组装（用于填补 gap）
  -o ragtag_patch_output \
  -t 16

# 自定义比对参数
ragtag.py scaffold \
  reference.fa \
  query_assembly.fa \
  -o output \
  -t 16 \
  --aligner minimap2 \           # 使用 minimap2（默认）
  -i 0.5 \                       # 最小比对同一性（默认 0.2）
  -a 0 \                         # 最小比对长度（默认 1000）
  -f 10000                       # 最小 scaffold 片段长度

# 强制不改变 contig 方向（只排列顺序）
ragtag.py scaffold \
  reference.fa \
  query_assembly.fa \
  -o output_no_flip \
  -t 16 \
  -r                             # 移除未放置的 contig（不输出到结果中）

# 设置最小分组置信度
ragtag.py scaffold \
  reference.fa \
  query_assembly.fa \
  -o output_confident \
  -t 16 \
  -q 10 \                        # 最小 MAPQ 值（过滤低质量比对）
  -d 100000                      # 最大合并距离

# 完整流程：correct → scaffold → patch
ragtag.py correct reference.fa query.fa -o step1_correct -t 16
ragtag.py scaffold reference.fa step1_correct/ragtag.correct.fasta -o step2_scaffold -t 16
ragtag.py patch reference.fa step2_scaffold/ragtag.scaffold.fasta -o step3_patch -t 16

结果验证¶

# 统计 scaffolding 结果
seqkit stats ragtag_scaffold_output/ragtag.scaffold.fasta

# 查看 AGP 文件（了解 contig 排列）
head ragtag_scaffold_output/ragtag.scaffold.agp
# AGP 格式告诉你每条 scaffold 由哪些 contig 组成，以及它们的顺序和方向

# 用 QUAST 评估
quast ragtag_scaffold_output/ragtag.scaffold.fasta -r reference.fa -o quast_after_ragtag

# 用 BUSCO 验证完整性没有下降
busco -i ragtag_scaffold_output/ragtag.scaffold.fasta -o busco_ragtag -m genome -l lineage -c 16

常见问题与踩坑¶

问题1：参考基因组与目标物种差异太大¶

原因：RagTag 依赖序列相似性进行 scaffolding，远缘物种效果差
建议：参考基因组应来自同种或近缘物种（同属最佳），序列同一性 >80%

问题2：有些 contig 未被放置¶

原因：这些 contig 在参考基因组上找不到匹配位置
解决：它们会被标记为 _unplaced 保留在输出中；可能是物种特有序列或污染

问题3：RagTag vs Hi-C scaffolding¶

RagTag 优势：不需要额外实验数据，有参考基因组就能用
Hi-C 优势：不依赖参考基因组，能发现物种特有的染色体重排
建议：有 Hi-C 数据优先用 Hi-C；没有就用 RagTag 作为替代

问题4：scaffold 引入了参考基因组的错误¶

风险：如果参考基因组有错误组装，RagTag 可能会"继承"这些错误
防范：先用 ragtag.py correct 修正明显的错误连接；scaffolding 后做独立验证

速查卡片¶

命令/参数	用途
`ragtag.py scaffold ref.fa query.fa -o out`	参考引导 scaffolding
`ragtag.py correct ref.fa query.fa -o out`	修正错误组装
`ragtag.py patch ref.fa query.fa -o out`	修补 gap
`-t 16`	线程数
`-i 0.5`	最小比对同一性
`-q 10`	最小 MAPQ 值
`-r`	移除未放置的 contig
`ragtag.scaffold.fasta`	scaffolding 结果
`ragtag.scaffold.agp`	AGP 排列信息
`ragtag.correct.fasta`	修正后的序列