STARsolo — 单细胞RNA-seq高速比对与定量工具¶

# STAR（内含STARsolo）安装
# 方法1：conda安装（推荐，最新版STAR ≥ 2.7.11）
conda create -n starsolo python=3.9
conda activate starsolo
conda install -c bioconda star   # 安装最新STAR（包含STARsolo）

# 验证安装
STAR --version    # 应显示 2.7.11a 或更新版本

# 方法2：下载预编译二进制
wget https://github.com/alexdobin/STAR/releases/download/2.7.11b/STAR_2.7.11b.zip
unzip STAR_2.7.11b.zip
./STAR_2.7.11b/Linux_x86_64/STAR --version

# 构建STAR基因组索引（首次使用必须，约30分钟）
STAR \
    --runMode genomeGenerate \         # 基因组构建模式
    --genomeDir /data/STAR_genome_hg38 \  # 索引输出目录（需提前创建）
    --genomeFastaFiles hg38.fasta \    # 参考基因组
    --sjdbGTFfile gencode.v47.gtf \   # 基因注释GTF（用最新版）
    --runThreadN 16                    # 线程数

# 下载白名单（cell barcode白名单，10x提供）
# 10x v3白名单（约600万个barcode）
wget https://github.com/10XGenomics/cellranger/raw/main/lib/python/cellranger/barcodes/3M-february-2018.txt.gz
gunzip 3M-february-2018.txt.gz   # 解压为TXT文件

# 标准10x v3单细胞3'分析
STAR \
    --soloType CB_UMI_Simple \         # 单细胞类型：barcode+UMI简单模式
    --soloCBwhitelist 3M-february-2018.txt \  # 10x v3 barcode白名单
    --soloCBstart 1 --soloCBlen 16 \   # barcode在R1的位置（1-16bp）
    --soloUMIstart 17 --soloUMIlen 12 \  # UMI在R1的位置（17-28bp）
    --genomeDir /data/STAR_genome_hg38 \  # 基因组索引目录
    --readFilesIn R2.fastq.gz R1.fastq.gz \  # 注意：R2在前（cDNA），R1在后（barcode+UMI）
    --readFilesCommand zcat \          # FASTQ.GZ文件解压命令
    --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \  # 输出排序BAM
    --outSAMattributes NH HI nM AS CR UR CB UB GX GN sS sQ sM \  # SAM属性
    --runThreadN 16 \                  # 线程数
    --outFileNamePrefix starsolo_out/  # 输出目录前缀

# 10x v2参数（barcode长度16bp，UMI 10bp）
STAR \
    --soloType CB_UMI_Simple \
    --soloCBwhitelist 737K-august-2016.txt \  # v2白名单
    --soloCBstart 1 --soloCBlen 16 \
    --soloUMIstart 17 --soloUMIlen 10 \       # v2 UMI是10bp（非12bp）
    --genomeDir /data/STAR_genome_hg38 \
    --readFilesIn R2.fastq.gz R1.fastq.gz \
    --readFilesCommand zcat \
    --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
    --runThreadN 16 \
    --outFileNamePrefix starsolo_v2_out/

STAR \
    --soloType CB_UMI_Simple \
    --soloCBwhitelist 3M-february-2018.txt \
    --soloCBstart 1 --soloCBlen 16 \
    --soloUMIstart 17 --soloUMIlen 12 \
    --soloFeatures Gene Velocyto \     # 同时输出Gene计数和RNA velocity所需数据
    --soloCellFilter EmptyDrops_CR \   # 使用EmptyDrops算法过滤空液滴（类似CellRanger）
    --genomeDir /data/STAR_genome_hg38 \
    --readFilesIn R2.fastq.gz R1.fastq.gz \
    --readFilesCommand zcat \
    --outSAMtype None \                # 不输出BAM（只要矩阵，节省空间）
    --runThreadN 16 \
    --outFileNamePrefix starsolo_velocity_out/

# 完整10x v3分析流程

GENOME_DIR="/data/STAR_genome_hg38"
WHITELIST="/data/3M-february-2018.txt"
# FASTQ文件（可以是多lane）
R1_FASTQ="sample_S1_L001_R1_001.fastq.gz"
R2_FASTQ="sample_S1_L001_R2_001.fastq.gz"

# 1. 运行STARsolo（推荐参数，类CellRanger效果）
STAR \
    --soloType CB_UMI_Simple \
    --soloCBwhitelist $WHITELIST \
    --soloCBstart 1 --soloCBlen 16 \
    --soloUMIstart 17 --soloUMIlen 12 \
    --soloCBmatchWLtype 1MM_multi_pseudocounts \
    --soloUMIfiltering MultiGeneUMI_CR \
    --soloUMIdedup 1MM_CR \
    --soloCellFilter EmptyDrops_CR \
    --soloFeatures Gene Velocyto \
    --clipAdapterType CellRanger4 \
    --outFilterScoreMin 30 \
    --genomeDir $GENOME_DIR \
    --readFilesIn $R2_FASTQ $R1_FASTQ \
    --readFilesCommand zcat \
    --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
    --outSAMattributes NH HI nM AS CR UR CB UB GX GN sS sQ sM \
    --runThreadN 24 \
    --outFileNamePrefix starsolo_results/

# 2. 查看输出结构
ls starsolo_results/Solo.out/Gene/
# raw/      - 未过滤矩阵（所有barcode）
# filtered/ - 过滤后矩阵（推测的真实细胞）
#   barcodes.tsv   - 细胞barcode
#   features.tsv   - 基因列表
#   matrix.mtx     - 稀疏计数矩阵

# 3. 用R/Seurat读取（与CellRanger输出兼容）
# 在R中:
# library(Seurat)
# counts <- Read10X("starsolo_results/Solo.out/Gene/filtered/")
# seurat_obj <- CreateSeuratObject(counts, project="my_project")

# 4. 统计映射率
grep "Uniquely mapped reads %" starsolo_results/Log.final.out
grep "Number of input reads" starsolo_results/Log.final.out