DAS Tool¶

一句话概述¶

MAG质量评估就像给组装出来的基因组做"体检"，看它有多完整（completeness）、有多少污染（contamination），以及是不是被别的物种基因"混进来"了（嵌合体chimerism）。

核心知识点表格¶

知识点	说明
CheckM2	用机器学习预测MAG的完整度和污染度，比CheckM1更快更准
GUNC	检测基因组嵌合体（不同物种的contigs混在一起），CheckM检测不了
DAS Tool	整合多个binner的结果，得到最优的非冗余bin集合
MIMAG标准	高质量MAG: >90%完整度, <5%污染度; 中质量: >50%完整度, <10%污染度
Binette	2024年新工具，使用CheckM2进行bin精化，比MetaWRAP更快

白话解释¶

假设你在玩拼图： - CheckM2 = 检查你的拼图拼了多少（完整度）、有没有把别的拼图碎片混进来（污染度） - GUNC = 检查你的拼图是不是把两幅不同画的碎片混在一起了（嵌合体检测） - DAS Tool = 你请了好几个人各自拼一遍，然后挑出每个人拼得最好的那些部分组合在一起

三个工具配合使用，才能全面评估MAG质量。

各工具详解¶

CheckM2¶

白话解释： CheckM2是MAG质量评估的"金标准"工具。它用机器学习模型来预测基因组的完整度和污染度，不需要知道这个基因组属于什么物种就能评估。

版本信息： 最新版v1.1.0（2025年2月发布），使用GTDB r214数据库训练。

与CheckM1的区别： | 特性 | CheckM1 | CheckM2 | |------|---------|---------| | 方法 | 基于谱系特异性标记基因 | 机器学习模型 | | 速度 | 较慢 | 快10-50倍 | | 对稀有物种 | 表现差 | 表现好（如Nanoarchaeota） | | 依赖 | 需要参考基因组谱系树 | 通用模型，不依赖谱系 |

# 安装CheckM2（推荐用conda）
conda create -n checkm2 -c bioconda -c conda-forge checkm2  # 创建独立环境
conda activate checkm2  # 激活环境

# 下载数据库（约3.5GB，只需下载一次）
checkm2 database --download --path /path/to/checkm2_db  # 下载参考数据库

# 设置数据库路径
export CHECKM2DB=/path/to/checkm2_db  # 设置环境变量

# 运行CheckM2评估MAG质量
checkm2 predict \
    --input bins_dir/ \      # 输入MAG所在目录
    --output-directory checkm2_results/ \  # 输出目录
    -x fa \                  # MAG文件扩展名（fa/fasta/fna）
    --threads 16             # 使用16个线程

# 查看结果
cat checkm2_results/quality_report.tsv  # 查看质量报告

结果解读：

# quality_report.tsv 关键列：
# Name          — MAG名称
# Completeness  — 完整度（%），越高越好
# Contamination — 污染度（%），越低越好
# Genome_Size   — 基因组大小（bp）
# GC_Content    — GC含量
# Coding_Density — 编码密度

# MIMAG质量分级标准：
# 高质量(HQ): Completeness > 90%, Contamination < 5%
# 中质量(MQ): Completeness > 50%, Contamination < 10%
# 低质量(LQ): Completeness < 50% 或 Contamination > 10%

GUNC（Genome UNClutterer）¶

白话解释： GUNC专门检测基因组嵌合体——就是两个不同物种的contigs被错误地混到了一个bin里。CheckM2检测不了这种问题，因为嵌合体可能"看起来"很完整、污染也不高，但实际上是两个物种拼在一起的"弗兰肯斯坦"。

为什么需要GUNC？ 研究发现5-15%的"高质量"MAG实际上是未被检测到的嵌合体！

# 安装GUNC
conda install -c bioconda gunc  # 安装gunc

# 下载GUNC数据库
gunc download_db /path/to/gunc_db  # 下载参考数据库

# 运行GUNC检测嵌合体
gunc run \
    --input_dir bins_dir/ \       # 输入MAG目录
    --db_file /path/to/gunc_db/gunc_db_progenomes2.1.dmnd \  # 数据库文件
    --out_dir gunc_results/ \     # 输出目录
    --threads 16                  # 线程数

# 合并CheckM2和GUNC结果
gunc merge_checkm \
    --gunc_file gunc_results/GUNC.progenomes_2.1.maxCSS_level.tsv \  # GUNC结果
    --checkm_file checkm2_results/quality_report.tsv \  # CheckM2结果
    --out_file merged_quality.tsv  # 合并输出

GUNC结果解读：

# 关键指标：
# CSS (Clade Separation Score) — 嵌合体分离得分
#   CSS > 0.45 → 可能是嵌合体，需要警惕
#   CSS < 0.45 → 基本安全

# pass.GUNC 列：
#   True  → 通过GUNC检测，不是嵌合体
#   False → 未通过，可能是嵌合体，建议丢弃或重新binning

DAS Tool¶

白话解释： DAS Tool是一个"裁判工具"，它把多个binning工具的结果放在一起比较，从中挑出最好的、不重复的bin组合。就像选秀节目，多个评委各自挑了一些选手，DAS Tool负责去重和选出最终名单。

版本信息： 最新版v1.1.7（2024年12月更新）

# 安装DAS Tool
conda install -c bioconda das_tool  # 安装DAS Tool

# 第一步：将每个binner的结果转换为DAS Tool输入格式
# 格式：contig_id \t bin_id（制表符分隔的两列）

# MetaBAT2结果转换
Fasta_to_Contig2Bin.sh \
    -i metabat2_bins/ \      # MetaBAT2输出的bins目录
    -e fa \                  # 文件扩展名
    > metabat2_contigs2bin.tsv  # 输出转换文件

# SemiBin2结果转换
Fasta_to_Contig2Bin.sh \
    -i semibin_bins/ \       # SemiBin2输出的bins目录
    -e fa \
    > semibin_contigs2bin.tsv

# 第二步：运行DAS Tool整合
DAS_Tool \
    -i metabat2_contigs2bin.tsv,semibin_contigs2bin.tsv \  # 输入多个binner的结果
    -l MetaBAT2,SemiBin2 \   # 对应的binner名称标签
    -c contigs.fa \          # 输入contigs文件
    -o das_tool_output \     # 输出前缀
    --write_bins \           # 输出精化后的bin文件
    --write_unbinned \       # 输出未binning的contigs
    -t 16 \                  # 线程数
    --score_threshold 0.5    # 得分阈值，默认0.5

# 第三步：查看结果
cat das_tool_output_DASTool_summary.tsv  # 查看汇总报告

完整的MAG质量评估流程¶

# ====== 推荐的完整流程 ======

# 1. 多个binner运行binning
# （参见592_宏基因组binning策略对比.md）

# 2. DAS Tool整合多个binner结果
DAS_Tool -i metabat2.tsv,semibin.tsv -l MB2,SB2 \
    -c contigs.fa -o refined --write_bins -t 16

# 3. CheckM2评估质量
checkm2 predict --input refined_DASTool_bins/ \
    --output-directory checkm2_out/ -x fa -t 16

# 4. GUNC检测嵌合体
gunc run --input_dir refined_DASTool_bins/ \
    --db_file gunc_db.dmnd --out_dir gunc_out/ -t 16

# 5. 筛选高质量MAG
# 使用Python脚本合并结果并筛选
python3 << 'EOF'
import pandas as pd  # 导入pandas

# 读取CheckM2结果
checkm = pd.read_csv("checkm2_out/quality_report.tsv", sep="\t")  # 读取质量报告

# 读取GUNC结果
gunc = pd.read_csv("gunc_out/GUNC.progenomes_2.1.maxCSS_level.tsv", sep="\t")  # 读取GUNC结果

# 合并两个表
merged = checkm.merge(gunc[["genome", "pass.GUNC"]], 
                       left_on="Name", right_on="genome")  # 按MAG名称合并

# 筛选高质量MAG（MIMAG标准 + GUNC通过）
hq_mags = merged[
    (merged["Completeness"] > 90) &   # 完整度>90%
    (merged["Contamination"] < 5) &   # 污染度<5%
    (merged["pass.GUNC"] == True)     # GUNC检测通过
]

# 输出结果
hq_mags.to_csv("high_quality_MAGs.tsv", sep="\t", index=False)  # 保存结果
print(f"高质量MAG数量: {len(hq_mags)}")  # 打印数量
EOF

新工具推荐：Binette（2024年）¶

白话解释： Binette是MetaWRAP bin精化模块的替代品，内部使用CheckM2评估，但通过复用中间结果（Prodigal和DIAMOND的输出）大幅加速了过程。

# 安装Binette
conda install -c bioconda binette  # 安装binette

# 运行Binette精化
binette \
    -d metabat2_bins semibin_bins \  # 输入多个binner的bins目录
    -c contigs.fa \                  # 输入contigs
    -o binette_output \              # 输出目录
    -t 16                            # 线程数

常见报错与解决¶

报错	原因	解决方案
`CheckM2 database not found`	没下载或没设置数据库路径	`checkm2 database --download` 并设置 `CHECKM2DB` 环境变量
`pplacer fails` (CheckM1)	内存不足	改用CheckM2，不需要pplacer
GUNC报`diamond`相关错误	DIAMOND版本不兼容	`conda install diamond=2.1.8` 指定兼容版本
DAS Tool报`Fasta_to_Scaffolds2Bin.sh not found`	DAS Tool版本>1.1.3改了脚本名	用`Fasta_to_Contig2Bin.sh`替代
`No bins found matching extension`	文件扩展名不匹配	检查 `-e` 或 `-x` 参数（fa/fasta/fna）
CheckM2 `tensorflow`版本冲突	Python/TensorFlow版本不兼容	建议用独立conda环境安装v1.1.0

速查表¶

# MAG质量分级（MIMAG标准）
高质量(HQ): Completeness > 90%, Contamination < 5%
中质量(MQ): Completeness > 50%, Contamination < 10%
低质量(LQ): 其他

# 工具选择
质量评估（必选）→ CheckM2
嵌合体检测（推荐）→ GUNC
bin精化整合（推荐）→ DAS Tool 或 Binette

# 推荐流程
多个Binner → DAS Tool整合 → CheckM2评估 → GUNC筛嵌合体 → 筛选HQ/MQ MAG

# 最新版本（2025年）
CheckM2: v1.1.0（数据库v3）
GUNC: v1.0.6
DAS Tool: v1.1.7
Binette: v1.0+

# 常用命令速查
checkm2 predict --input bins/ -o out/ -x fa -t 16
gunc run --input_dir bins/ --db_file db.dmnd -o out/ -t 16
DAS_Tool -i a.tsv,b.tsv -l A,B -c contigs.fa -o out --write_bins -t 16

面试高频问题¶

Q1：为什么需要同时用CheckM2和GUNC？

A：CheckM2主要检测完整度和污染度，但它检测不了嵌合体（两个不同物种的contigs混在一起）。嵌合体MAG可能显示高完整度、低污染度，但实际上是错误的。GUNC专门检测这种嵌合体问题。研究发现5-15%的"高质量"MAG是未检测到的嵌合体。

Q2：CheckM2相比CheckM1有什么改进？

A：三个主要改进：①速度更快（10-50倍）；②对稀有/特殊物种更准确（如Nanoarchaeota、Patescibacteria这类基因组缩小的物种）；③使用通用机器学习模型，不依赖特定谱系的标记基因。

Q3：DAS Tool的工作原理是什么？

A：DAS Tool接收多个binning工具的结果，用单拷贝标记基因评估每个bin的质量得分，然后通过优化算法选出最优的非冗余bin集合。它不自己做binning，而是"裁判"角色。

Q4：什么是MIMAG标准？

A：MIMAG（Minimum Information about a Metagenome-Assembled Genome）是2017年发表的MAG报告最低标准。高质量MAG需要>90%完整度、<5%污染度，并且要有23S、16S、5S rRNA基因和至少18个tRNA基因。

Q5：如果CheckM2显示高完整度但GUNC不通过，你会怎么处理？

A：说明这个MAG可能是嵌合体。处理方法：①丢弃该MAG；②重新binning（可能需要更精细的参数）；③手动检查contigs的分类注释，看是否真的混了不同物种。