蛋白质组DIA分析¶

传统DDA采集方式：
  MS1扫描 → 选择强度最高的Top10-20个前体离子
  → 逐个碎裂做MS2 → 回到MS1 → 重复

DDA的问题：
  1. "有钱人效应"——只选最强的离子，低丰度蛋白被忽略
  2. 随机性——不同样本选到不同的离子，重复性差
  3. 缺失值多——50%以上的蛋白可能在部分样本中检测不到
  4. 动态范围有限——高丰度蛋白占用大量采集时间

DIA采集方式：
  把整个m/z范围（如400-1200 m/z）分成若干窗口（如25 Da一个窗口）
  每个窗口内所有前体离子同时碎裂
  → 结果是每个窗口的混合MS2谱

DIA的优势：
  1. 全覆盖——不遗漏任何前体离子
  2. 高重复性——每次采集相同的m/z范围
  3. 缺失值少——蛋白在不同样本中都能定量
  4. 定量准确——因为采集全面且一致

DIA的挑战：
  每个窗口的MS2谱是多个肽段的混合谱
  → 需要强大的算法"解卷积"（deconvolution）
  → 这就是DIA-NN和Spectronaut的核心任务

DIA窗口示意：
  窗口1: 400-425 m/z  → 混合MS2
  窗口2: 425-450 m/z  → 混合MS2
  窗口3: 450-475 m/z  → 混合MS2
  ...
  窗口32: 1175-1200 m/z → 混合MS2

# DIA-NN 2.5.1（2025-2026最新版）
# 下载地址：https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases

# Linux安装
wget https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/download/2.5.1/diann-2.5.1.tar.gz  # 下载
tar -xzf diann-2.5.1.tar.gz  # 解压
./diann --help                # 测试安装

# DIA-NN有两种版本：
# Academia版：有限功能，免费用于非营利学术研究
# Enterprise版：全功能，通过Aptila Biotech或Thermo Fisher获取

# ===== 方法1：从FASTA预测谱库（library-free，推荐） =====
# DIA-NN内置深度学习模型预测肽段碎裂模式
diann \
  --fasta uniprot_human.fasta \    # UniProt蛋白序列库
  --fasta-search \                 # 从FASTA搜索
  --lib \                          # 生成谱库
  --threads 8 \                    # 线程数
  --predictor \                    # 使用深度学习预测碎裂
  --out-lib predicted_lib.tsv      # 输出预测谱库

# ===== 方法2：从DDA数据建谱库（经验谱库） =====
# 如果有DDA采集的原始数据
diann \
  --f DDA_file1.raw \              # DDA原始数据
  --f DDA_file2.raw \
  --fasta uniprot_human.fasta \
  --lib \
  --threads 8 \
  --out-lib empirical_lib.tsv      # 输出经验谱库

# library-free方法已经足够好
# 只有追求最大深度或靶向分析时才需要建经验谱库

# 使用DIA-NN分析DIA原始数据
diann \
  --f sample1.raw \                # DIA原始数据文件1
  --f sample2.raw \                # DIA原始数据文件2
  --f sample3.raw \                # DIA原始数据文件3
  --lib predicted_lib.tsv \        # 谱库（或用--fasta直接搜索）
  --fasta uniprot_human.fasta \    # 蛋白序列库
  --threads 16 \                   # 线程数
  --out report.tsv \               # 主输出报告
  --out-lib refined_lib.tsv \      # 精炼后的谱库
  --qvalue 0.01 \                  # FDR阈值1%
  --matrices \                     # 输出定量矩阵
  --smart-profiling \              # 智能谱图分析
  --met-excision \                 # 考虑N端甲硫氨酸切除
  --cut K*,R* \                    # 胰蛋白酶切割规则
  --missed-cleavages 1 \           # 允许1个漏切位点
  --min-pep-len 7 \                # 最小肽段长度7
  --max-pep-len 30 \               # 最大肽段长度30
  --min-pr-charge 2 \              # 最小前体电荷2+
  --max-pr-charge 4 \              # 最大前体电荷4+
  --var-mods 1 \                   # 可变修饰数
  --var-mod UniMod:35,15.994915,M  # 甲硫氨酸氧化修饰

# DIA-NN输出文件说明：
# report.tsv — 所有鉴定的肽段和蛋白
# report.pg_matrix.tsv — 蛋白组定量矩阵
# report.pr_matrix.tsv — 前体离子定量矩阵
# report.gg_matrix.tsv — 基因组定量矩阵
# report.stats.tsv — 运行统计信息

# 完全不需要预先建库，直接从FASTA搜索
# 2025-2026年推荐的方法

diann \
  --f sample1.raw \
  --f sample2.raw \
  --fasta uniprot_human.fasta \    # 直接用FASTA
  --fasta-search \                 # 启用FASTA搜索模式
  --threads 16 \
  --out report.tsv \
  --qvalue 0.01 \
  --matrices \
  --smart-profiling \
  --predictor                      # 用深度学习预测碎裂

# Library-free模式的优势：
# 1. 不需要DDA数据建库
# 2. 不需要购买谱库数据库
# 3. 结果通常和经验谱库相当
# 4. 更适合非模式生物

Spectronaut是Biognosys公司的商业DIA分析软件

特点：
  - GUI界面友好，适合不会命令行的用户
  - 自动参数优化
  - 内置统计分析和可视化
  - 标准化的报告输出
  - 支持directDIA（library-free）模式

价格：需要购买License，学术版约$2000-5000/年

Spectronaut vs DIA-NN对比（2026年Benchmark）：
  - 两者在肺腺癌样本中都鉴定>7600个蛋白
  - 共同鉴定7180个蛋白（重叠率>94%）
  - Spectronaut差异蛋白：1250上调/266下调
  - DIA-NN差异蛋白：1819上调/174下调
  - Top50差异蛋白中34个重叠

# 使用SpectroPipeR处理Spectronaut输出
# install.packages("SpectroPipeR")  # 2025年Bioinformatics发表
library(SpectroPipeR)

# 读取Spectronaut导出的报告
data <- read_spectronaut("spectronaut_report.tsv")  # 读取报告

# 自动化分析流水线
result <- spectropiper(
  data = data,
  condition_col = "Condition",     # 条件列名
  comparison = c("Tumor", "Normal"),  # 比较组
  fdr_threshold = 0.01,           # FDR阈值
  log2fc_threshold = 1            # log2FC阈值
)

# 输出包括：
# - 标准化的蛋白定量矩阵
# - 差异蛋白列表
# - 火山图和热图
# - 功能富集结果

# DIA-NN输出的下游统计分析
library(tidyverse)

# 1. 读取DIA-NN蛋白定量矩阵
protein_matrix <- read.delim("report.pg_matrix.tsv")  # 读取蛋白矩阵
rownames(protein_matrix) <- protein_matrix$Protein.Group  # 设置行名

# 2. 数据预处理
# 移除反库和污染物蛋白
protein_clean <- protein_matrix %>%
  filter(!grepl("^REV_", Protein.Group)) %>%   # 去除反库蛋白
  filter(!grepl("^CON_", Protein.Group))        # 去除污染物

# log2转换
quant_cols <- grep("raw$", colnames(protein_clean))  # 定量列
protein_log2 <- protein_clean
protein_log2[, quant_cols] <- log2(protein_clean[, quant_cols])  # log2转换

# 缺失值处理
missing_pct <- rowMeans(is.na(protein_log2[, quant_cols]))  # 缺失比例
protein_filtered <- protein_log2[missing_pct < 0.5, ]  # 保留<50%缺失的蛋白
cat("过滤后蛋白数:", nrow(protein_filtered), "\n")

# 3. 差异蛋白分析（limma）
library(limma)

# 设计矩阵
group <- factor(c(rep("Tumor", 3), rep("Normal", 3)))  # 分组
design <- model.matrix(~ 0 + group)                      # 设计矩阵
colnames(design) <- levels(group)

# limma分析
fit <- lmFit(protein_filtered[, quant_cols], design)   # 拟合
contrast <- makeContrasts(Tumor - Normal, levels = design)  # 对比
fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast)                   # 对比拟合
fit3 <- eBayes(fit2)                                   # 贝叶斯估计

# 提取结果
dep_results <- topTable(fit3, number = Inf)            # 所有结果
sig_proteins <- dep_results %>%
  filter(adj.P.Val < 0.05 & abs(logFC) > 1)            # 显著差异蛋白
cat("显著差异蛋白数:", nrow(sig_proteins), "\n")

# 4. 火山图
library(EnhancedVolcano)
EnhancedVolcano(dep_results,
  lab = rownames(dep_results),     # 蛋白名标签
  x = "logFC",                     # X轴：log2FC
  y = "adj.P.Val",                 # Y轴：调整后P值
  pCutoff = 0.05,                  # P值阈值线
  FCcutoff = 1,                    # FC阈值线
  title = "Tumor vs Normal")       # 标题

# 5. 功能富集
library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)

# 上调蛋白的GO富集
up_proteins <- sig_proteins %>% filter(logFC > 0)  # 上调蛋白
ego <- enrichGO(
  gene = rownames(up_proteins),
  OrgDb = org.Hs.eg.db,
  keyType = "UNIPROT",            # UniProt ID
  ont = "BP",
  pvalueCutoff = 0.05
)
dotplot(ego, showCategory = 15)   # 气泡图

# DIA分析工具选择决策树

┌─ 预算充足 + GUI偏好？
│  └─ 是 → Spectronaut
│  └─ 否 → DIA-NN（免费开源）
│
├─ 有DDA数据建库？
│  └─ 是 → 经验谱库 + DIA-NN/Spectronaut
│  └─ 否 → Library-free模式（推荐）
│
├─ 需要自动化流水线？
│  └─ 是 → FragPipe（开源，CI友好）
│  └─ 否 → DIA-NN命令行足够
│
├─ 磷酸化蛋白组？
│  └─ Spectronaut覆盖最高
│  └─ DIA-NN变异性最低
│
└─ 临床大队列（>100个样本）？
   └─ DIA-NN（速度快，library-free）

# DIA分析流程
原始数据(.raw/.mzML) → DIA-NN/Spectronaut搜索
→ 蛋白定量矩阵 → 标准化 → 缺失值处理
→ 差异分析(limma) → 功能富集(clusterProfiler)

# DIA-NN关键参数
--fasta-search: library-free模式
--qvalue 0.01: 1% FDR
--matrices: 输出定量矩阵
--smart-profiling: 智能谱图分析
--predictor: 深度学习碎裂预测
--threads: 线程数（建议≥8）

# FDR控制标准
肽段FDR: ≤1%
蛋白FDR: ≤1%
推荐同时使用target-decoy策略

# 工具对比
DIA-NN: 免费，命令行，library-free优秀
Spectronaut: 商业，GUI友好，报告完善
FragPipe: 免费，流水线，适合自动化
SpectroPipeR: R包，后处理Spectronaut数据

# 典型鉴定数量（人类细胞系）
DIA-NN library-free: 6000-8000蛋白
Spectronaut directDIA: 6000-8000蛋白
DDA+谱库方法: 7000-9000蛋白