临床变异 ACMG 分类标准¶

一句话概述：ACMG/AMP 指南将遗传变异分为5个等级（致病、可能致病、意义不明、可能良性、良性），是临床基因检测报告解读的金标准。

核心知识点速查表¶

概念	白话解释
ACMG	美国医学遗传学与基因组学学院
5级分类	P/LP/VUS/LB/B（致病/可能致病/意义不明/可能良性/良性）
证据强度	Very Strong/Strong/Moderate/Supporting 四个等级
PVS1	最强致病证据：功能丧失变异（LOF）在已知基因中
BS1	强良性证据：等位基因频率高于预期
ClinVar	NCBI的变异临床解读数据库
InterVar	自动化ACMG分类工具
VUS	意义不明变异（最让临床头疼的类别）

一、ACMG 分类体系（白话版）¶

比喻：ACMG分类就像法庭判案。你收集各种"证据"（人群频率、功能实验、家系分离等），每条证据有不同的"分量"（强证据、中等证据、支持性证据），最后综合所有证据做"判决"（致病/良性/不确定）。

五级分类¶

级别	英文	含义	临床行动
P	Pathogenic（致病）	确定致病	可用于诊断和治疗决策
LP	Likely Pathogenic（可能致病）	>90%可能致病	可谨慎用于临床
VUS	Variant of Uncertain Significance	不确定	不能用于临床决策
LB	Likely Benign（可能良性）	>90%可能良性	通常不报告
B	Benign（良性）	确定良性	不报告

二、28条证据标准详解¶

致病证据（Pathogenic Evidence）¶

# 致病证据分4个强度等级：

# Very Strong (PVS1)
PVS1: 功能丧失变异（nonsense/frameshift/splice site）
      在一个已知LOF是致病机制的基因中
      白话：这个基因坏了就会得病，而这个突变把基因彻底搞坏了

# Strong (PS1-PS4)
PS1: 同一氨基酸位置的已知致病变异（不同核苷酸变化但同一氨基酸改变）
PS2: 新生突变（de novo），父母未携带但孩子有
PS3: 功能实验验证有害（体外实验证明蛋白功能受损）
PS4: 病例中频率显著高于对照（关联分析显著）

# Moderate (PM1-PM6)
PM1: 位于热点区域或功能域，且无良性变异
PM2: 在gnomAD等群体数据库中极罕见或缺失
PM3: 对于隐性遗传病，在反式（另一条染色体）上有已知致病变异
PM4: 非重复区域的框内缺失/插入，或终止密码子丢失
PM5: 同一位置有已知致病的不同氨基酸改变
PM6: 假设的新生突变（未确认父母关系）

# Supporting (PP1-PP5)
PP1: 与疾病在家系中共分离
PP2: 错义突变在该基因中是常见致病机制
PP3: 计算工具预测有害（SIFT/PolyPhen/CADD等）
PP4: 患者表型高度特异于该基因
PP5: 可靠来源报告为致病（如ClinVar中多个实验室一致）

良性证据（Benign Evidence）¶

# Stand-alone (BA1)
BA1: 等位基因频率>5%（任何群体），独立判定良性

# Strong (BS1-BS4)
BS1: 等位基因频率高于疾病预期
BS2: 在健康纯合/半合个体中观察到（对于完全外显的疾病）
BS3: 功能实验无害
BS4: 缺乏与疾病的共分离（家系分析不支持）

# Supporting (BP1-BP7)
BP1: 在截短变异是致病机制的基因中的错义变异
BP2: 在显性遗传病中以反式出现已知致病变异
BP3: 重复区域的框内缺失/插入
BP4: 计算工具预测无害
BP5: 在有其他分子解释的病例中发现
BP6: 可靠来源报告为良性
BP7: 同义变异，预测不影响剪接

三、ACMG 分类实操¶

第 1 步：收集证据¶

# 工具1：InterVar（自动化ACMG分类）
# 安装
pip install intervar  # 安装InterVar
# 或下载
git clone https://github.com/WGLab/InterVar.git

# 准备输入（ANNOVAR格式的变异注释）
# 先用ANNOVAR注释变异
perl table_annovar.pl \
    input.avinput \              # 输入变异文件
    humandb/ \                    # 数据库目录
    -buildver hg38 \             # 基因组版本
    -out annotated \             # 输出前缀
    -protocol refGene,clinvar_20240917,gnomad40_genome,dbnsfp42a \  # 数据库
    -operation g,f,f,f \         # 操作类型
    -nastring .                  # 缺失值

# 运行InterVar
python InterVar.py \
    -i annotated.hg38_multianno.txt \  # ANNOVAR注释结果
    -d humandb/ \                       # 数据库目录
    -b hg38 \                           # 基因组版本
    -o intervar_output                  # 输出前缀

第 2 步：查询数据库¶

# ========== Python脚本：查询ClinVar ==========
import requests                                       # HTTP请求

def query_clinvar(variant_id):
    """查询ClinVar中的变异分类"""
    url = f"https://eutils.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/esearch.fcgi"
    params = {
        "db": "clinvar",                              # ClinVar数据库
        "term": variant_id,                           # 变异ID
        "retmode": "json"                             # 返回JSON
    }
    response = requests.get(url, params=params)       # 发送请求
    return response.json()                            # 返回结果

# 查询示例
result = query_clinvar("NM_000546.6:c.215C>G")       # TP53的一个变异
print(result)

# 常用数据库URL：
# ClinVar: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
# gnomAD: https://gnomad.broadinstitute.org/
# LOVD: https://www.lovd.nl/
# ClinGen: https://clinicalgenome.org/

第 3 步：计算工具预测¶

# 常用变异致病性预测工具
# CADD (Combined Annotation Dependent Depletion)
# CADD score > 20 → top 1% 有害
# CADD score > 30 → top 0.1% 有害

# REVEL (Rare Exome Variant Ensemble Learner)
# REVEL > 0.5 → 可能致病
# REVEL > 0.7 → 高置信度致病

# AlphaMissense (Google DeepMind, 2023)
# 基于AlphaFold的错义突变致病性预测
# 分三类：likely pathogenic / ambiguous / likely benign

# 在线查询CADD分数
# https://cadd.gs.washington.edu/score

# 批量查分数（使用CADD API）
curl -X POST "https://cadd.gs.washington.edu/api/v1.0/GRCh38" \
     -H "Content-Type: application/json" \
     -d '{"variants": ["1-55516888-G-A", "17-7676154-G-A"]}'

第 4 步：综合判定¶

# 致病判定规则：
# P (Pathogenic):
#   (i) 1 Very Strong + ≥1 Strong
#   (ii) 1 Very Strong + ≥2 Moderate
#   (iii) 1 Very Strong + 1 Moderate + 1 Supporting
#   (iv) 1 Very Strong + ≥2 Supporting
#   (v) ≥2 Strong
#   (vi) 1 Strong + ≥3 Moderate
#   (vii) 1 Strong + 2 Moderate + ≥2 Supporting
#   (viii) 1 Strong + 1 Moderate + ≥4 Supporting

# LP (Likely Pathogenic):
#   (i) 1 Very Strong + 1 Moderate
#   (ii) 1 Strong + 1-2 Moderate
#   (iii) 1 Strong + ≥2 Supporting
#   (iv) ≥3 Moderate
#   (v) 2 Moderate + ≥2 Supporting
#   (vi) 1 Moderate + ≥4 Supporting

四、常见报错与注意事项¶

问题	说明	解决方法
VUS 比例太高	很多变异证据不足	收集更多证据（功能实验、家系分析）
不同实验室分类不一致	证据标准解读差异	参考ClinGen专家组分类
PM2 的频率阈值不确定	不同疾病的阈值不同	根据疾病患病率计算最大可信频率
PP3 不能单独用	计算预测只是支持性证据	必须与其他证据组合
体细胞变异不适用	ACMG只针对胚系变异	体细胞用 AMP/ASCO/CAP 分类

五、面试高频问题¶

Q1：ACMG 5级分类分别是什么？

Pathogenic（致病）、Likely Pathogenic（可能致病）、VUS（意义不明）、Likely Benign（可能良性）、Benign（良性）。关键区别：P和LP可用于临床决策，VUS不能，LB和B通常不报告。

Q2：如何处理 VUS？

(1) 不能用VUS做临床决策；(2) 收集更多证据：功能实验、家系分离分析、时间推移重评估；(3) ClinGen专家组可能对特定基因有更细化的分类标准；(4) 建议定期重评估VUS。

Q3：PVS1 什么时候不能用？

当：(1) 基因的LOF不是已知致病机制时（如某些基因LOF是良性的）；(2) 截短变异位于最后一个外显子；(3) 存在选择性剪接可能绕过该变异时。

六、速查表¶

# === ACMG 分类速查 ===

# 5级分类：P → LP → VUS → LB → B

# 常用致病证据：
# PVS1 — LOF变异在已知LOF致病基因
# PS2  — de novo新生突变
# PM2  — 群体数据库中极罕见
# PP3  — 计算工具预测有害

# 常用良性证据：
# BA1  — 人群频率>5%，独立判良性
# BS1  — 频率高于疾病预期
# BP4  — 计算工具预测无害
# BP7  — 同义变异不影响剪接

# 自动化工具：
# InterVar — 自动ACMG分类
# Franklin — 在线ACMG分类 (https://franklin.genoox.com/)
# VarSome — 在线变异注释 (https://varsome.com/)
# ClinVar — 变异临床数据库

# 预测工具评分阈值：
# CADD > 20 → top 1% 有害
# REVEL > 0.5 → 可能致病
# AlphaMissense > 0.564 → likely pathogenic

参考资料：Richards et al. 2015 (ACMG/AMP Guidelines, Genetics in Medicine)、ClinGen 2024更新、ACGS UK 2024 Guidelines