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基因组注释流程（Prokka / BRAKER / MAKER）

一句话概述

基因组注释是将组装好的基因组序列"翻译"为生物学信息（基因位置、功能、调控元件等）的过程，本教程覆盖原核基因组（Prokka）和真核基因组（BRAKER/MAKER）的完整注释流程。

目录

1. 核心知识点

序号步骤工具目的输入输出关键参数
1重复序列屏蔽RepeatMasker屏蔽重复序列避免干扰基因预测基因组FASTA屏蔽后FASTA-species, -pa
2原核基因预测Prodigal预测原核生物基因基因组FASTAGFF + 蛋白序列-p meta(宏基因组)
3原核全面注释Prokka一站式原核注释基因组FASTAGFF/GBK/FAA/FFN--kingdom, --genus
4RNA-seq证据生成HISAT2+StringTie生成转录组证据RNA-seq readsBAM + GTF链特异性设置
5蛋白证据比对GeneMarkS-T/miniprot蛋白同源证据蛋白数据库GFF hints--softmasking
6从头基因预测Augustus/GeneMark-ESab initio基因预测屏蔽后基因组GFF预测训练物种模型
7BRAKER注释BRAKER2/3整合证据的真核注释基因组+RNA/蛋白证据GFF + 蛋白序列--etpmode, --softmasking
8MAKER注释MAKER循环迭代式真核注释基因组+多源证据GFF + 蛋白序列多轮训练
9功能注释InterProScan/eggNOG预测蛋白功能和结构域蛋白序列功能注释表数据库选择
10注释质量评估BUSCO/AED评估注释完整性注释GFF + 蛋白完整性报告lineage数据集

2. 各步骤详解

步骤1：重复序列屏蔽

白话解释：基因组中有大量重复序列（转座子、卫星DNA等），如果不先标记出来，基因预测软件可能会把它们误认为基因。"屏蔽"就是用小写字母（soft masking）或N字符（hard masking）标记这些区域。

技术细节：

重复序列屏蔽对真核基因组注释至关重要（原核基因组重复较少，Prokka内部处理）。对于真核基因组，重复序列通常占30-80%。

两种屏蔽方式： - Soft masking：将重复区域改为小写字母（推荐，因为BRAKER/MAKER需要这些区域的序列信息） - Hard masking：将重复区域替换为N（某些工具需要）

建议先用RepeatModeler构建物种特异的重复序列库，再用RepeatMasker进行屏蔽。对于非模式生物，这一步尤为重要。

# RepeatModeler构建物种特异重复库
BuildDatabase -name genome_db genome.fa
RepeatModeler -database genome_db -pa 16 -LTRStruct

# RepeatMasker屏蔽（soft masking）
RepeatMasker -pa 16 \
  -lib genome_db-families.fa \
  -xsmall \
  -gff \
  genome.fa

# 如果是模式生物，可直接使用内置库
RepeatMasker -pa 16 \
  -species "arabidopsis" \
  -xsmall \
  -gff \
  genome.fa

步骤2：原核基因预测（Prodigal）

白话解释：原核生物的基因结构简单（没有内含子），Prodigal是一个快速准确的原核基因预测工具，它通过识别开放阅读框（ORF）和训练物种特异的参数来预测基因。

技术细节：

Prodigal的工作原理： 1. 从输入序列中学习GC含量、密码子使用偏好、RBS（核糖体结合位点）模式等参数 2. 使用动态规划算法在所有可能的ORF中找到最优基因集合 3. 考虑重叠基因、非标准起始密码子等原核特征

运行模式： - Normal模式（默认）：适合单个基因组，会从数据中训练参数 - Meta模式（-p meta）：适合宏基因组，使用预训练参数（因为宏基因组中每个物种的序列可能太少无法单独训练）

Prodigal是Prokka内部调用的核心基因预测引擎，通常不需要单独运行，除非只需要基因坐标而不需要完整注释。

# 标准模式（单个基因组）
prodigal -i genome.fa \
  -o genes.gff \
  -a proteins.faa \
  -d nucleotides.fna \
  -f gff \
  -p single

# 宏基因组模式
prodigal -i metagenome_contigs.fa \
  -o meta_genes.gff \
  -a meta_proteins.faa \
  -f gff \
  -p meta

步骤3：原核全面注释（Prokka）

白话解释：Prokka是原核基因组注释的"全家桶"工具，一个命令就能完成基因预测、功能注释、rRNA/tRNA预测、信号肽预测等所有工作，输出标准的GenBank和GFF格式文件。

技术细节：

Prokka的内部流程： 1. 预测编码基因（Prodigal） 2. 预测rRNA（Barrnap） 3. 预测tRNA（Aragorn） 4. 预测非编码RNA（Infernal + Rfam） 5. 预测信号肽（SignalP，如可用） 6. 功能注释：逐层搜索数据库 - 小型可信数据库（ISfinder、HAMAP等）→ 高置信注释 - UniProt（带实验证据的条目）→ 中置信 - Pfam域→ 补充域注释 - 如无匹配 → "hypothetical protein"

关键参数： - --kingdom：Bacteria/Archaea/Viruses - --genus/--species：指定物种，用于选择注释数据库 - --proteins：额外的可信蛋白数据库（如近缘物种的注释蛋白） - --rfam：启用Rfam搜索（较慢但更完整）

# 基本运行
prokka genome.fa \
  --outdir prokka_output \
  --prefix my_genome \
  --kingdom Bacteria \
  --genus Escherichia \
  --species coli \
  --strain K12 \
  --cpus 16 \
  --rfam \
  --addgenes

# 使用自定义蛋白数据库
prokka genome.fa \
  --outdir prokka_output \
  --prefix my_genome \
  --kingdom Bacteria \
  --proteins trusted_proteins.faa \
  --cpus 16

# 输出文件说明：
# .gff  - GFF3格式注释
# .gbk  - GenBank格式（可用Artemis查看）
# .faa  - 蛋白序列
# .ffn  - 基因核酸序列
# .fna  - 基因组序列（包含注释）
# .tbl  - 特征表（GenBank提交格式）
# .tsv  - 基因功能汇总表
# .txt  - 统计摘要

步骤4：RNA-seq证据生成

白话解释：对于真核基因组注释，RNA-seq数据是最有力的证据之一——它直接告诉我们基因组的哪些区域被转录了、内含子在哪里（通过剪接junction reads）。将RNA-seq比对到基因组后，可以用StringTie组装转录本。

技术细节：

RNA-seq证据用于BRAKER/MAKER的方式： - Intron hints：剪接junction reads直接提供内含子边界信息（最有价值） - Exon hints：覆盖的区域提示外显子位置 - 组装的转录本：StringTie或Trinity组装的转录本提供完整基因模型参考

BRAKER可以直接接收BAM文件，内部会提取hints。MAKER需要额外提供组装好的转录本序列（如Trinity的EST evidence）。

链特异性建库的RNA-seq数据对注释特别有帮助，因为它能区分正负链上重叠的基因。

# 1. RNA-seq比对
hisat2-build genome_masked.fa genome_index

hisat2 -x genome_index \
  -1 rnaseq_R1.fastq.gz \
  -2 rnaseq_R2.fastq.gz \
  --dta \
  --rna-strandness RF \
  -p 16 \
  | samtools sort -@ 8 -o rnaseq_sorted.bam

samtools index rnaseq_sorted.bam

# 2. StringTie组装转录本
stringtie rnaseq_sorted.bam \
  -o stringtie.gtf \
  -p 16 \
  --rf

# 3. 提取转录本序列（用于MAKER）
gffread stringtie.gtf -g genome.fa -w transcripts.fa

步骤5：蛋白证据比对

白话解释：除了RNA-seq，近缘物种的已知蛋白序列也是重要的注释证据。如果一段基因组序列能很好地比对到一个已知蛋白，那这段区域很可能包含一个同源基因。

技术细节：

蛋白证据可用于： - 验证从头预测的基因是否正确 - 发现从头预测遗漏的基因 - 辅助确定正确的外显子-内含子边界

推荐的蛋白数据库来源： - OrthoDB：正交同源蛋白数据库（BRAKER推荐使用） - 近缘物种的已注释蛋白集合 - SwissProt/UniProt经实验验证的蛋白

比对工具选择： - miniprot：速度快，适合大规模蛋白-基因组比对（BRAKER3推荐） - GenomeThreader：经典的蛋白-基因组拼接比对 - DIAMOND+Exonerate：先快速筛选再精确比对（MAKER使用）

# miniprot蛋白比对（BRAKER3使用）
miniprot -t 16 --gff genome_masked.fa proteins_db.fa > protein_hints.gff

# GenomeThreader蛋白比对
genomethreader -genomic genome_masked.fa \
  -protein proteins_db.fa \
  -gff3out \
  -o protein_alignments.gff3

# DIAMOND预筛选 + Exonerate精确比对（MAKER方式）
diamond makedb --in proteins_db.fa -d proteins_db
diamond blastx -d proteins_db -q genome.fa -o diamond_hits.tab -f 6 -e 1e-5

步骤6：从头基因预测（Ab initio）

白话解释：从头预测（ab initio prediction）不依赖外部证据，而是根据DNA序列本身的统计特征（如密码子频率、剪接位点信号、基因长度分布等）来预测基因。它需要先"训练"一个物种特异的模型。

技术细节：

主要的从头预测工具： - Augustus：目前最准确的从头预测工具之一，支持多种证据整合 - GeneMark-ES/ET：自训练（self-training）工具，不需要预先的训练集 - SNAP：较老但简单快速，常用于MAKER的迭代训练

训练策略： - GeneMark-ES：完全无监督，从基因组序列中自动学习参数（蛋白编码序列 vs 非编码序列的特征差异） - Augustus训练：需要高质量的基因模型作为训练集（可来自RNA-seq支持的基因或OrthoDB同源蛋白） - BRAKER的自动训练：结合GeneMark和Augustus，自动迭代优化模型

对于非模式生物，从头预测的质量很大程度上取决于训练数据的质量。这就是为什么BRAKER/MAKER采用迭代策略——用第一轮的结果训练模型，再用新模型重新预测。

# GeneMark-ES自训练
gmes_petap.pl --ES \
  --sequence genome_masked.fa \
  --soft_mask auto \
  --cores 16

# Augustus预测（使用已训练模型）
augustus --species=arabidopsis \
  --softmasking=1 \
  --gff3=on \
  genome_masked.fa > augustus_predictions.gff3

# SNAP训练和预测
# 从已知基因模型训练SNAP
maker2zff -d maker_output.maker.output/maker_output_datastore_index.log
fathom genome.ann genome.dna -gene-stats > gene_stats.txt
fathom genome.ann genome.dna -validate > validate.txt
fathom genome.ann genome.dna -categorize 1000
fathom uni.ann uni.dna -export 1000 -plus
forge export.ann export.dna
hmm-assembler.pl my_species . > my_species.hmm

步骤7：BRAKER注释

白话解释：BRAKER是一个自动化的真核基因组注释管线，它整合了GeneMark和Augustus的从头预测能力与RNA-seq/蛋白证据，自动训练模型并产生最终注释。BRAKER3是最新版本，支持同时使用RNA-seq和蛋白证据。

技术细节：

BRAKER的版本和模式： - BRAKER1：仅使用RNA-seq证据 - BRAKER2：仅使用蛋白证据（通过ProtHint） - BRAKER3：同时使用RNA-seq和蛋白证据（推荐） - ETPmode（--etpmode）：整合RNA-seq + 蛋白 + 从头预测（BRAKER3默认模式）

BRAKER的内部流程： 1. 从RNA-seq BAM提取intron hints 2. 用ProtHint/miniprot生成蛋白hints 3. 运行GeneMark-ET/EP训练基因模型 4. 将GeneMark预测的高质量基因作为Augustus训练集 5. 训练Augustus参数 6. 运行Augustus整合所有hints产生最终预测 7. 用TSEBRA选择最佳基因模型

# BRAKER3（同时使用RNA-seq和蛋白证据）
braker.pl \
  --genome=genome_masked.fa \
  --bam=rnaseq_sorted.bam \
  --prot_seq=orthodb_proteins.fa \
  --softmasking \
  --etpmode \
  --threads 16 \
  --species=my_species \
  --workingdir=braker_output

# BRAKER1模式（仅RNA-seq）
braker.pl \
  --genome=genome_masked.fa \
  --bam=rnaseq_sorted.bam \
  --softmasking \
  --threads 16 \
  --species=my_species

# BRAKER2模式（仅蛋白证据，适合无RNA-seq的情况）
braker.pl \
  --genome=genome_masked.fa \
  --prot_seq=orthodb_proteins.fa \
  --softmasking \
  --epmode \
  --threads 16 \
  --species=my_species

步骤8：MAKER注释

白话解释：MAKER是另一个主流的真核基因组注释管线，特色是"迭代式"——第一轮用所有证据做初步注释，然后用这些结果训练预测模型，再用新模型做第二轮、第三轮注释，每轮质量递增。

技术细节：

MAKER与BRAKER的区别： - MAKER更灵活，支持更多类型的证据和预测工具 - MAKER需要更多手动配置（三个控制文件） - MAKER使用AED（Annotation Edit Distance）评估注释质量 - MAKER适合需要精细控制的复杂注释项目

MAKER的三个配置文件： - maker_opts.ctl：主要选项（输入文件路径、参数设置） - maker_bopts.ctl：BLAST相关参数 - maker_exe.ctl：外部程序路径

推荐的MAKER迭代策略（3轮）： 1. 第1轮：仅使用EST/蛋白证据（不做ab initio），生成证据支持的基因模型 2. 用第1轮结果训练SNAP和Augustus 3. 第2轮：加入训练好的SNAP和Augustus 4. 用第2轮结果重新训练 5. 第3轮：最终注释

# 生成配置文件模板
maker -CTL

# 编辑maker_opts.ctl（关键参数）
# genome=genome_masked.fa
# est=transcripts.fa
# protein=proteins.fa
# rmlib=repeat_library.fa
# augustus_species=my_species
# snaphmm=my_species.hmm

# 第1轮运行（仅证据）
maker -cpus 16 maker_opts.ctl maker_bopts.ctl maker_exe.ctl

# 提取第1轮结果
gff3_merge -d my_genome.maker.output/my_genome_master_datastore_index.log
fasta_merge -d my_genome.maker.output/my_genome_master_datastore_index.log

# 训练SNAP
maker2zff -d my_genome.maker.output/my_genome_master_datastore_index.log
fathom genome.ann genome.dna -categorize 1000
fathom uni.ann uni.dna -export 1000 -plus
forge export.ann export.dna
hmm-assembler.pl my_species . > my_species_round1.hmm

# 修改maker_opts.ctl加入训练后模型，运行第2轮...

步骤9：功能注释

白话解释：结构注释（基因预测）告诉我们基因在哪里，功能注释则告诉我们这些基因做什么——是酶？是转录因子？属于什么代谢通路？有什么结构域？

技术细节：

功能注释的主要方法： 1. 序列相似性搜索：BLAST/DIAMOND比对SwissProt/NR数据库 2. 结构域/家族注释：InterProScan整合多个数据库（Pfam、TIGRFAM、CDD等） 3. 直系同源分组：eggNOG-mapper基于进化关系推断功能 4. GO/KEGG注释：通过上述工具获得Gene Ontology和KEGG通路注释 5. 特殊注释：信号肽（SignalP）、跨膜域（TMHMM）、亚细胞定位（DeepLoc）

推荐流程：InterProScan（最全面） + eggNOG-mapper（通路注释） + DIAMOND/BLAST（补充）

# InterProScan功能注释
interproscan.sh \
  -i predicted_proteins.faa \
  -o interproscan_results.tsv \
  -f tsv,gff3 \
  -goterms \
  -iprlookup \
  -pa \
  -cpu 16

# eggNOG-mapper注释
emapper.py \
  -i predicted_proteins.faa \
  -o eggnog_results \
  --cpu 16 \
  -m diamond \
  --tax_scope Bacteria \
  --go_evidence non-electronic \
  --pfam_realign denovo

# DIAMOND比对SwissProt
diamond blastp \
  -d swissprot \
  -q predicted_proteins.faa \
  -o diamond_swissprot.tab \
  -f 6 qseqid sseqid pident length evalue bitscore stitle \
  -e 1e-5 \
  --threads 16 \
  --sensitive

步骤10：注释质量评估

白话解释：注释做完后需要评估质量：预测的基因数量合理吗？该有的保守基因都找到了吗？基因结构（外显子/内含子）看起来合理吗？BUSCO是评估基因组和注释完整性的金标准工具。

技术细节：

BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs）原理： - 每个进化谱系都有一组"应该存在的"单拷贝保守基因 - 如果注释中能找到这些基因的大部分，说明注释质量好 - 结果分为：Complete (C)、Duplicated (D)、Fragmented (F)、Missing (M)

评判标准： - Complete > 90%：高质量注释 - Complete 70-90%：可接受 - Complete < 70%：可能存在问题

其他评估指标： - AED分布（MAKER）：AED=0最完美（注释与证据完全一致），AED>0.5的基因可能有问题 - 基因数量：与近缘物种比较是否合理 - 基因结构统计：平均外显子数、平均基因长度、内含子长度分布 - 转录组支持率：多少预测基因有RNA-seq支持

# BUSCO评估注释的蛋白集
busco -i predicted_proteins.faa \
  -o busco_proteins \
  -m proteins \
  -l bacteria_odb10 \
  -c 16

# 对于真核生物
busco -i predicted_proteins.faa \
  -o busco_proteins \
  -m proteins \
  -l embryophyta_odb10 \
  -c 16

# 基因组水平BUSCO（评估组装+注释）
busco -i genome.fa \
  -o busco_genome \
  -m genome \
  -l embryophyta_odb10 \
  -c 16

# 注释统计
# 基因数、平均长度、外显子数等
awk '$3=="gene"' annotation.gff3 | wc -l
awk '$3=="exon"' annotation.gff3 | wc -l

3. 实战命令/代码（完整流程）

#!/bin/bash
# =====================================================
# 基因组注释完整流程
# Part A: 原核基因组注释（Prokka）
# Part B: 真核基因组注释（BRAKER3）
# =====================================================

set -euo pipefail

# ==========================
# Part A: 原核基因组注释
# ==========================
echo "=========================================="
echo " Part A: 原核基因组注释 (Prokka)"
echo "=========================================="

PROK_GENOME="bacterial_genome.fa"
PROK_OUT="annotation_prokaryote"
mkdir -p ${PROK_OUT}

# 运行Prokka
prokka ${PROK_GENOME} \
  --outdir ${PROK_OUT}/prokka \
  --prefix bacterium \
  --kingdom Bacteria \
  --genus Escherichia \
  --species coli \
  --cpus 16 \
  --rfam \
  --addgenes \
  --compliant \
  --force

# 查看注释统计
echo "--- Prokka注释统计 ---"
cat ${PROK_OUT}/prokka/bacterium.txt

# BUSCO评估
busco -i ${PROK_OUT}/prokka/bacterium.faa \
  -o ${PROK_OUT}/busco_prokka \
  -m proteins \
  -l bacteria_odb10 \
  -c 16

echo ""
echo "=========================================="
echo " Part B: 真核基因组注释 (BRAKER3)"
echo "=========================================="

# ==========================
# Part B: 真核基因组注释
# ==========================

EUK_GENOME="eukaryote_genome.fa"
RNASEQ_R1="rnaseq_R1.fastq.gz"
RNASEQ_R2="rnaseq_R2.fastq.gz"
PROTEIN_DB="orthodb_v11_plants.fa"
EUK_OUT="annotation_eukaryote"
THREADS=16

mkdir -p ${EUK_OUT}/{repeat_mask,rnaseq,braker,functional,evaluation}

# ---- Step 1: 重复序列屏蔽 ----
echo "[Step 1] 重复序列屏蔽..."
BuildDatabase -name ${EUK_OUT}/repeat_mask/genome_db ${EUK_GENOME}
RepeatModeler -database ${EUK_OUT}/repeat_mask/genome_db \
  -pa ${THREADS} -LTRStruct

RepeatMasker -pa ${THREADS} \
  -lib ${EUK_OUT}/repeat_mask/genome_db-families.fa \
  -xsmall -gff \
  -dir ${EUK_OUT}/repeat_mask \
  ${EUK_GENOME}

MASKED_GENOME="${EUK_OUT}/repeat_mask/$(basename ${EUK_GENOME}).masked"
echo "重复序列比例:"
grep -c "^>" ${EUK_OUT}/repeat_mask/*.tbl || true

# ---- Step 2: RNA-seq比对 ----
echo "[Step 2] RNA-seq比对..."
hisat2-build ${MASKED_GENOME} ${EUK_OUT}/rnaseq/genome_index

hisat2 -x ${EUK_OUT}/rnaseq/genome_index \
  -1 ${RNASEQ_R1} -2 ${RNASEQ_R2} \
  --dta --rna-strandness RF \
  -p ${THREADS} \
  | samtools sort -@ 8 -o ${EUK_OUT}/rnaseq/rnaseq.bam

samtools index ${EUK_OUT}/rnaseq/rnaseq.bam

# ---- Step 3: BRAKER3注释 ----
echo "[Step 3] BRAKER3注释..."
braker.pl \
  --genome=${MASKED_GENOME} \
  --bam=${EUK_OUT}/rnaseq/rnaseq.bam \
  --prot_seq=${PROTEIN_DB} \
  --softmasking \
  --etpmode \
  --threads ${THREADS} \
  --species=my_eukaryote \
  --workingdir=${EUK_OUT}/braker \
  --gff3

# 提取蛋白序列
BRAKER_GFF="${EUK_OUT}/braker/braker.gtf"
gffread ${BRAKER_GFF} -g ${MASKED_GENOME} -y ${EUK_OUT}/braker/proteins.faa

echo "预测基因数: $(grep -c 'gene' ${BRAKER_GFF} | head -1)"

# ---- Step 4: 功能注释 ----
echo "[Step 4] 功能注释..."
# InterProScan
interproscan.sh \
  -i ${EUK_OUT}/braker/proteins.faa \
  -o ${EUK_OUT}/functional/interproscan.tsv \
  -f tsv,gff3 \
  -goterms -iprlookup -pa \
  -cpu ${THREADS}

# eggNOG-mapper
emapper.py \
  -i ${EUK_OUT}/braker/proteins.faa \
  -o ${EUK_OUT}/functional/eggnog \
  --cpu ${THREADS} \
  -m diamond

# ---- Step 5: 质量评估 ----
echo "[Step 5] 质量评估..."
busco -i ${EUK_OUT}/braker/proteins.faa \
  -o ${EUK_OUT}/evaluation/busco \
  -m proteins \
  -l embryophyta_odb10 \
  -c ${THREADS}

echo ""
echo "=== 注释完成 ==="
echo "原核注释: ${PROK_OUT}/prokka/"
echo "真核注释: ${EUK_OUT}/braker/"
echo "功能注释: ${EUK_OUT}/functional/"
echo "质量评估: ${EUK_OUT}/evaluation/"

4. 面试常问点

Q1：原核和真核基因组注释的主要区别是什么？

原核基因结构简单（无内含子、操纵子组织），基因密度高（~85%编码），Prokka可在分钟内完成注释。真核基因结构复杂（多外显子、大量内含子），基因密度低（仅~2%编码），需要多源证据整合和迭代训练，注释耗时长（小时到天）。真核注释必须先屏蔽重复序列（可占50%+），原核则不太需要。

Q2：BRAKER和MAKER各自的优缺点是什么？什么情况下选择哪个？

BRAKER优点：自动化程度高、配置简单、对RNA-seq/蛋白证据利用充分。缺点：灵活性较低、不支持所有类型的证据。MAKER优点：高度可定制、支持多种预测工具和证据类型、迭代训练策略。缺点：配置复杂、运行时间长。选择建议：有RNA-seq和/或蛋白证据时首选BRAKER3；需要精细控制或特殊注释需求时用MAKER。

Q3：为什么从头基因预测需要物种特异的训练？

不同物种的基因组特征差异很大：GC含量、密码子偏好、内含子长度分布、剪接位点信号强度等都不同。用人的参数去预测植物基因会产生大量错误。训练让预测模型学习目标物种特有的统计特征。对于非模式生物，GeneMark-ES的自训练策略或BRAKER的自动训练流程解决了这个"先有鸡还是先有蛋"的问题。

Q4：Soft masking和Hard masking有什么区别？为什么推荐soft masking？

Soft masking将重复区域的碱基改为小写（atcg），Hard masking替换为N。推荐soft masking因为：(1)保留了序列信息，某些基因可能位于重复元素附近或部分重叠；(2)基因预测工具可以选择性忽略soft-masked区域（不在其中起始搜索），但允许基因模型延伸进入这些区域；(3)Hard masking会永久丢失信息，可能导致某些真实基因被截断。

Q5：BUSCO如何评估注释质量？Complete/Fragmented/Missing各代表什么？

BUSCO搜索预期在目标分类群中普遍存在的单拷贝直系同源基因。Complete：在注释中找到了完整的基因（全长匹配）。Fragmented：找到了部分匹配但不完整（可能基因模型有错误或基因组组装不完整）。Missing：完全找不到（可能注释遗漏或基因组缺失）。Duplicated：找到了多个拷贝（可能是组装冗余或真实的近期基因复制）。Complete>95%是高质量基因组注释的标志。

Q6：RNA-seq数据在基因组注释中有什么作用？

RNA-seq提供了直接的转录证据：(1)剪接junction reads精确定位内含子边界（最有价值）；(2)覆盖模式指示外显子区域；(3)组装的转录本提供完整基因模型参考；(4)链特异性信息帮助区分重叠基因的方向。在没有RNA-seq时，真核基因组注释的准确率显著下降，特别是对于小外显子和非典型剪接位点。

Q7：InterProScan和eggNOG-mapper在功能注释中各自的优势是什么？

InterProScan整合了13+个数据库（Pfam、TIGRFAM、SUPERFAMILY、Gene3D等），对蛋白质结构域和家族的注释最全面，是域水平功能注释的首选。eggNOG-mapper基于正交同源组（Orthologous Groups）进行注释，特别擅长提供GO、KEGG、COG分类等通路级别的注释，且速度比InterProScan快。两者互补，建议同时使用。

5. 易错/易混淆点

  1. 忘记屏蔽重复序列就做真核注释：不屏蔽重复会导致大量虚假基因预测（转座子被预测为基因），且从头预测的模型训练会被重复序列污染。必须先做重复屏蔽。

  2. 基因组版本与RNA-seq比对不一致：如果基因组在比对后被修改（如scaffold命名变化），BAM文件中的坐标会与当前基因组不匹配。确保所有步骤使用同一版本的基因组。

  3. BRAKER的物种名重复使用：如果之前用相同的--species名运行过BRAKER/Augustus，新运行会失败或使用旧的训练参数。使用--species=new_unique_name或删除旧的Augustus config目录。

  4. Prokka对真核生物使用不当：Prokka是原核生物注释工具，不能预测内含子。对真核生物使用Prokka会产生完全错误的基因模型。反之，BRAKER对原核生物也不适用。

  5. 蛋白证据数据库选择不当：使用过于远缘物种的蛋白集会导致比对质量差，误导基因预测。使用OrthoDB同一分类群的蛋白子集（如植物用Viridiplantae，昆虫用Insecta）效果最好。

  6. GFF格式混淆：GFF2、GFF3和GTF格式有微妙差异。不同工具可能输出不同格式，直接将一种格式传给期望另一种格式的工具会出错。使用gffread或AGAT进行格式转换。

  7. 忽略基因组组装质量对注释的影响：如果基因组组装高度碎片化（大量短contigs），基因可能被打断在多个contigs上，导致注释产生大量片段化基因。应在注释前评估组装连续性（N50、BUSCO）。

6. 补充知识

注释格式详解

  • GFF3：通用基因特征格式，9列制表符分隔，支持层次关系（gene→mRNA→exon/CDS）
  • GTF/GFF2：类似GFF3但属性格式不同，Ensembl常用
  • GenBank：NCBI提交格式，包含序列+注释
  • EMBL：EBI格式，类似GenBank

非编码RNA注释

除蛋白编码基因外，非编码RNA也是重要的注释目标： - rRNA：Barrnap（原核/真核）或RNAmmer - tRNA：tRNAscan-SE - miRNA：miRDeep2（需小RNA测序数据） - lncRNA：CPC2/CNCI区分编码与非编码 - 其他ncRNA：Infernal + Rfam数据库

推荐资源

  • Prokka: https://github.com/tseemann/prokka
  • BRAKER: https://github.com/Gaius-Augustus/BRAKER
  • MAKER: https://www.yandell-lab.org/software/maker.html
  • Augustus: https://github.com/Gaius-Augustus/Augustus
  • BUSCO: https://busco.ezlab.org/
  • InterProScan: https://www.ebi.ac.uk/interpro/
  • 综述: Yandell & Ence (2012) "A beginner's guide to eukaryotic genome annotation" Nature Reviews Genetics

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167_植物基因组分析
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转座子与重复序列注释（RepeatMasker / RepeatModeler / EDTA）
30% 相关
基因组完整性BUSCO评估
27% 相关