840. 长读长测序前沿应用¶

短读长测序（Illumina）= 把一本书撕成碎片（每片150字），再拼回去
→ 精度高，但遇到重复段落（重复序列）就拼不对了
→ 就像拼图碎片太小，很多地方看起来一样

长读长测序 = 把书撕成大段（每段上万字），再拼回去
→ 每段包含足够多的上下文信息
→ 重复段落两头有不同内容，可以唯一定位
→ 就像大块拼图，很容易找到位置

所以：
- 基因组组装（特别是重复区域）→ 长读长优势巨大
- 结构变异检测（大片段插入/删除/倒位）→ 长读长能直接跨过
- 全长转录本（mRNA从头到尾完整读取）→ 不需要拼接
- DNA甲基化（纳米孔直接读取修饰信号）→ 不需要亚硫酸盐处理

# Dorado —— ONT新一代碱基识别工具（替代Guppy）
# 2024-2025年ONT官方推荐

# 基础碱基识别
dorado basecaller \                    # 碱基识别
    sup \                              # 超精确模型(sup>hac>fast)
    pod5_dir/ \                        # 输入POD5原始信号
    --device cuda:0 \                  # 使用GPU
    > calls.bam                        # 输出BAM格式

# 同时检测甲基化修饰
dorado basecaller \
    sup \                              # 超精确模型
    pod5_dir/ \
    --modified-bases 5mCG_5hmCG \      # 检测5mC和5hmC修饰
    > calls_with_mods.bam              # 输出含修饰信息的BAM

# 自适应采样（实时选择性测序）
# 在测序过程中实时分析读长
# 如果读长不属于目标区域→反转电压→弹出分子
# 相当于实时"选择性测序"

# 直接RNA测序（dRNA-seq）—— 不需要反转录！
# 直接读取天然RNA分子

# 优势：
# 1. 保留RNA修饰信息（m6A等）
# 2. 获得全长转录本
# 3. 直接测量poly(A)尾巴长度
# 4. 无PCR扩增偏差

# 分析流程
minimap2 -ax splice \                  # 剪接感知比对
    -uf \                              # 正向链RNA
    --junc-bed junctions.bed \         # 已知剪接位点
    ref_genome.fa \                    # 参考基因组
    dRNA_reads.fastq \                 # 直接RNA reads
    | samtools sort -o aligned.bam     # 排序BAM

# RNA修饰检测
# 使用xPore或m6Anet检测m6A修饰
python -m xpore diffmod \              # xPore差异修饰分析
    --config config.yml                # 配置文件

# PacBio HiFi —— 高保真长读长（>99.9%准确率）

# CCS(Circular Consensus Sequencing)原理：
# DNA环化 → 聚合酶绕环多次测序 → 多次结果取共识
# 结果：每条读长10-25kb，准确率>99.9%

# HiFi数据分析流程
# 1. 基因组组装（hifiasm —— 当前最优组装器）
hifiasm -o assembly \                  # 输出前缀
    -t 32 \                            # 32线程
    --primary \                        # 输出主要组装
    hifi_reads.fastq.gz                # HiFi reads

# 2. 变异检测
pbmm2 align ref.fa \                   # PacBio比对工具
    hifi_reads.bam \                   # HiFi reads
    aligned.bam \                      # 输出BAM
    --sort \                           # 排序
    --preset CCS                       # HiFi预设

# DeepVariant PacBio模式
run_deepvariant \
    --model_type=PACBIO \              # PacBio模型
    --ref=ref.fa \                     # 参考基因组
    --reads=aligned.bam \              # 比对BAM
    --output_vcf=variants.vcf          # 输出VCF

T2T基因组 = 从染色体端粒到端粒的完整序列
→ 2022年：人类T2T-CHM13参考基因组发布
→ 填补了GRCh38中~200Mb的缺失区域
→ 长读长测序使这成为可能

技术要求：
→ ONT超长读长(100kb+) + PacBio HiFi
→ Hi-C辅助组装
→ 手动精修

# 长读长宏基因组 —— 2025热点

# 优势：
# 1. 更完整的MAG（基因组水平）
# 2. 完整操纵子和基因簇
# 3. 直接检测抗性基因的基因组上下文
# 4. 物种级别甚至菌株级别分辨率

# metaFlye组装
flye --nano-raw metagenome.fastq.gz \  # ONT宏基因组reads
    --meta \                           # 宏基因组模式
    --out-dir assembly/ \              # 输出目录
    --threads 32                       # 线程数

# 或使用PacBio HiFi
hifiasm-meta \                         # HiFi宏基因组组装器
    -o meta_asm \                      # 输出前缀
    -t 32 \                            # 线程
    hifi_meta.fastq.gz                 # HiFi reads

# ONT工具链 (2025)
碱基识别: Dorado (替代Guppy)
比对:     minimap2 -ax map-ont
组装:     Flye / Shasta
变异:     DeepVariant / Clair3
修饰:     modkit (甲基化分析)
RNA:      minimap2 -ax splice + xPore

# PacBio工具链
碱基识别: 仪器自带CCS
比对:     pbmm2 / minimap2 -ax map-hifi
组装:     hifiasm
变异:     DeepVariant --model_type PACBIO
修饰:     pb-CpG-tools

# 选型指南
基因组组装 → PacBio HiFi + ONT超长
结构变异 → 两者都可（ONT更经济）
甲基化 → ONT（直接检测）
RNA全长 → ONT dRNA-seq
现场检测 → ONT MinION