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单细胞拷贝数推断

一句话概述

利用inferCNV、CopyKAT、SCEVAN等工具从单细胞RNA-seq数据中推断拷贝数变异（CNV），区分肿瘤细胞与正常细胞，揭示肿瘤内异质性和克隆结构。

核心知识点总览

知识点关键内容重要程度
原理基础基因表达量与拷贝数的相关性⭐⭐⭐⭐⭐
inferCNVBroad开发的经典scRNA-CNV推断⭐⭐⭐⭐⭐
CopyKAT贝叶斯分割检测CNV/区分良恶性⭐⭐⭐⭐⭐
SCEVAN自动化变分推断CNV检测⭐⭐⭐⭐
参考细胞选择正常细胞作为基线的重要性⭐⭐⭐⭐
肿瘤细胞鉴定CNV pattern区分恶性/非恶性⭐⭐⭐⭐
克隆结构基于CNV的亚克隆分群⭐⭐⭐
与WGS/WES验证与DNA水平CNV的一致性⭐⭐⭐

各步骤详解

第一步：从表达推断拷贝数的原理

白话解释： 基因拷贝数增加（扩增）时，该区域的基因表达量通常也会升高；拷贝数减少（缺失）时表达量也会降低。虽然这种关系不是完美的（基因表达还受表观遗传等因素调控），但在基因组大片段水平上统计地成立。因此可以通过单细胞表达数据"反推"拷贝数变化。

技术细节： 核心方法论： 1. 将基因按染色体位置排序 2. 对每个细胞，计算滑动窗口内基因的平均表达量 3. 用正常细胞（免疫/基质细胞）作为基线参考 4. 残差信号即为推断的CNV（高于基线=扩增，低于=缺失）

局限性： - 分辨率有限（不能检测单基因水平的CNV） - 对表达沉默区域无法推断 - 依赖参考正常细胞的质量 - 与真实DNA水平CNV不完全一致

# 基因表达-拷贝数关系示意
# 假设chr8p存在缺失（loss）：
# 正常细胞：chr8p基因表达 = baseline
# 肿瘤细胞：chr8p基因表达 < baseline → 推断为deletion
#
# 假设chr8q存在扩增（gain）：
# 正常细胞：chr8q基因表达 = baseline
# 肿瘤细胞：chr8q基因表达 > baseline → 推断为amplification

第二步：inferCNV分析流程

白话解释： inferCNV是Broad研究所开发的最经典的scRNA-CNV推断工具。它需要三个输入：表达矩阵、细胞注释（指明哪些是参考正常细胞）、基因位置信息。它会生成一张热图，横轴是染色体位置，纵轴是细胞，颜色代表推断的拷贝数（红=扩增，蓝=缺失）。

技术细节：

# === inferCNV 完整流程 ===
library(infercnv)

# 1. 准备输入文件

# a) 原始count矩阵（基因×细胞）
# 从Seurat对象提取
counts_matrix <- GetAssayData(seurat_obj, slot = "counts")
# 保存为文件
write.table(as.matrix(counts_matrix), "inferCNV_counts.txt",
            sep = "\t", quote = FALSE)

# b) 细胞注释文件（细胞ID + 类型）
# 需要标注哪些是"参考"正常细胞
annotations <- data.frame(
  cell = colnames(seurat_obj),
  type = seurat_obj$celltype
)
# 参考细胞类型：免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞等
write.table(annotations, "inferCNV_annotations.txt",
            sep = "\t", quote = FALSE, col.names = FALSE, row.names = FALSE)

# c) 基因位置文件（基因名, chr, start, end）
# 从GTF提取
gene_order <- read.table("gene_ordering_file.txt", header = FALSE,
                          row.names = 1, sep = "\t")
# 格式：gene_symbol  chr  start  end

# 2. 创建inferCNV对象
infercnv_obj <- CreateInfercnvObject(
  raw_counts_matrix = "inferCNV_counts.txt",
  annotations_file = "inferCNV_annotations.txt",
  gene_order_file = "gene_ordering_file.txt",
  delim = "\t",
  ref_group_names = c("T_cells", "B_cells", "Macrophages", "Endothelial")
  # 指定参考细胞类型
)

# 3. 运行inferCNV
infercnv_obj <- infercnv::run(
  infercnv_obj,
  cutoff = 0.1,            # 10x Genomics用0.1，Smart-seq2用1
  out_dir = "inferCNV_output",
  cluster_by_groups = TRUE,
  denoise = TRUE,
  HMM = TRUE,              # 使用HMM预测CNV状态
  HMM_type = "i6",         # 6状态HMM
  num_threads = 16,
  analysis_mode = "subclusters",  # 亚克隆分析
  tumor_subcluster_partition_method = "random_trees",
  no_prelim_plot = TRUE
)

# 4. 结果文件
# inferCNV_output/infercnv.png          - CNV热图
# inferCNV_output/infercnv.observations.txt - 观测CNV矩阵
# inferCNV_output/HMM_CNV_predictions.*.txt - HMM预测的CNV状态

第三步：CopyKAT分析流程

白话解释： CopyKAT（Copy number Karyotyping of Aneuploid Tumors）是一个更简便的替代工具。它的特点是：不需要你事先指定哪些是正常细胞——它能自动区分非整倍体（肿瘤）细胞和二倍体（正常）细胞。

技术细节： CopyKAT使用贝叶斯分割（Bayesian segmentation）将基因组分成不同拷贝数状态的区段。然后基于CNV模式的层次聚类自动将细胞分为"整倍体"（diploid/正常）和"非整倍体"（aneuploid/肿瘤）两类。

# === CopyKAT 分析 ===
library(copykat)

# 输入：原始count矩阵
raw_counts <- as.matrix(GetAssayData(seurat_obj, slot = "counts"))

# 运行CopyKAT
copykat_results <- copykat(
  rawmat = raw_counts,
  id.type = "S",              # "S" for 10X, "E" for ENSEMBL
  ngene.chr = 5,              # 每个染色体最少基因数
  win.size = 25,              # 滑动窗口大小（基因数）
  KS.cut = 0.1,              # KS检验阈值
  sam.name = "tumor_sample",
  distance = "euclidean",
  norm.cell.names = NULL,     # NULL=自动检测；也可指定已知正常细胞
  n.cores = 16,
  output.seg = FALSE
)

# 查看预测结果
head(copykat_results$prediction)
# 列：cell.names, copykat.pred (aneuploid/diploid/not.defined)

# 将预测结果添加到Seurat对象
pred <- copykat_results$prediction
seurat_obj$copykat_pred <- pred$copykat.pred[match(colnames(seurat_obj), pred$cell.names)]

# 可视化
DimPlot(seurat_obj, group.by = "copykat_pred")

# 查看CNV矩阵
cnv_matrix <- copykat_results$CNAmat
# 行=基因组区段, 列=细胞

# 热图可视化
# CopyKAT自动生成热图：tumor_sample_copykat_heatmap.jpeg

# === 基于CNV的亚克隆分析 ===
# 提取肿瘤细胞
tumor_cells <- pred$cell.names[pred$copykat.pred == "aneuploid"]
tumor_cnv <- cnv_matrix[, tumor_cells]

# 层次聚类
hc <- hclust(dist(t(tumor_cnv)), method = "ward.D2")
# 切割树获得亚克隆
subclones <- cutree(hc, k = 3)  # 假设3个亚克隆

# 添加到Seurat
seurat_obj$subclone <- NA
seurat_obj$subclone[match(names(subclones), colnames(seurat_obj))] <- 
  paste0("Clone_", subclones)
DimPlot(seurat_obj, group.by = "subclone")

第四步：SCEVAN分析流程

白话解释： SCEVAN是较新的工具，使用变分推断自动检测CNV、识别肿瘤细胞、推断亚克隆。它的优势是高度自动化——不需要手动指定参考细胞，也不需要调太多参数。

技术细节：

# === SCEVAN 分析 ===
# devtools::install_github("AntonioDeFalco/SCEVAN")
library(SCEVAN)

# 输入：count矩阵
count_matrix <- as.matrix(GetAssayData(seurat_obj, slot = "counts"))

# 运行SCEVAN（自动模式）
results <- pipelineCNA(
  count_matrix,
  sample = "tumor_sample",
  par_cores = 16,
  SUBCLONES = TRUE,       # 是否检测亚克隆
  plotTree = TRUE          # 是否绘制进化树
)

# 结果解析
# results包含：
# - class_label: 每个细胞的分类（tumor/normal）
# - CNV_matrix: CNV推断矩阵
# - subclones: 亚克隆归属

# 提取肿瘤/正常分类
cell_classification <- results[[1]]
tumor_cells <- names(cell_classification[cell_classification == "tumor"])
normal_cells <- names(cell_classification[cell_classification == "normal"])

cat(sprintf("Tumor cells: %d\nNormal cells: %d\n",
            length(tumor_cells), length(normal_cells)))

# 查看亚克隆
if (!is.null(results$subclones)) {
  subclone_table <- table(results$subclones)
  print(subclone_table)
}

第五步：参考细胞选择策略

白话解释： CNV推断的质量很大程度上取决于参考细胞的选择。理想的参考细胞应该是确定无CNV的二倍体细胞。在肿瘤组织中，免疫细胞（T/B/NK/Myeloid）、血管内皮细胞和成纤维细胞通常是好的参考选择。

技术细节：

# === 参考细胞选择策略 ===

# 策略1：基于细胞类型注释（推荐）
# 使用高置信度注释的免疫/基质细胞
reference_types <- c("T_cell", "B_cell", "NK_cell", "Macrophage",
                      "Monocyte", "Endothelial", "Fibroblast")
ref_cells <- colnames(seurat_obj)[seurat_obj$celltype %in% reference_types]

# 策略2：使用外部正常组织的scRNA数据
# 如果肿瘤样本中正常细胞太少，可以引入配对正常组织数据
normal_tissue <- readRDS("normal_tissue_seurat.rds")
# 合并作为参考

# 策略3：使用已知的CNV-free markers验证参考细胞
# 检查参考细胞在已知频繁扩增/缺失区域的表达是否正常
# 如：chr7 gain和chr10 loss在GBM中常见
chr7_genes <- gene_order$gene[gene_order$chr == "chr7"]
chr10_genes <- gene_order$gene[gene_order$chr == "chr10"]

# 参考细胞的chr7/chr10表达应接近1（无CNV）
ref_chr7_mean <- mean(colMeans(counts_matrix[chr7_genes, ref_cells]))
ref_chr10_mean <- mean(colMeans(counts_matrix[chr10_genes, ref_cells]))

# 策略4：CopyKAT自动检测后验证
# 先用CopyKAT自动分离diploid细胞
# 然后检查diploid细胞的marker表达是否符合正常细胞特征
diploid_cells <- pred$cell.names[pred$copykat.pred == "diploid"]
# 验证这些细胞是否表达免疫/基质markers

第六步：CNV结果解读与下游分析

白话解释： 得到每个细胞的CNV pattern后，可以做很多有意义的下游分析：根据CNV将肿瘤细胞分成不同亚克隆、分析各亚克隆的转录特征差异、识别驱动CNV事件等。

技术细节：

# === CNV下游分析 ===

# 1. 基于CNV的聚类得到亚克隆
library(ComplexHeatmap)

# inferCNV输出的CNV矩阵
cnv_obs <- read.table("inferCNV_output/infercnv.observations.txt",
                       header = TRUE, check.names = FALSE)

# 只取肿瘤细胞
tumor_cnv <- cnv_obs[, tumor_cells]

# 聚类
set.seed(42)
hc_tumor <- hclust(as.dist(1 - cor(tumor_cnv)), method = "ward.D2")
k_clones <- 3  # 根据树形图选择合适的k
clone_assignment <- cutree(hc_tumor, k = k_clones)

# 热图展示亚克隆CNV特征
Heatmap(as.matrix(tumor_cnv),
        name = "CNV",
        column_split = factor(clone_assignment),
        cluster_rows = FALSE,
        show_column_names = FALSE,
        col = colorRamp2(c(0.8, 1, 1.2), c("blue", "white", "red")))

# 2. 各亚克隆的差异基因表达
seurat_tumor <- subset(seurat_obj, cells = tumor_cells)
seurat_tumor$clone <- paste0("Clone_", clone_assignment[colnames(seurat_tumor)])

# 找各克隆间差异基因
clone_markers <- FindAllMarkers(seurat_tumor, group.by = "clone",
                                 only.pos = TRUE, min.pct = 0.25)

# 3. CNV驱动基因识别
# 找到在CNV区域内且表达与CN同步变化的基因
# 这些可能是被CNV驱动的功能基因
gained_regions <- rownames(tumor_cnv)[rowMeans(tumor_cnv > 1.1) > 0.5]
# gained_regions中高表达的基因可能是驱动基因

# 4. 与bulk WGS/WES CNV比较验证
# 如果有配对的bulk CNV数据，可以验证scRNA推断的准确性
bulk_cnv <- read.table("bulk_cnv_segments.txt", header = TRUE)
# 计算相关性或一致性

第七步：工具比较与最佳实践

白话解释： 三个工具各有优劣，选择取决于你的数据特点和分析目标。对于需要精细亚克隆分析的用户，推荐用inferCNV（结果丰富）；对于快速筛查肿瘤/正常细胞，CopyKAT更方便；SCEVAN适合全自动化流程。

技术细节：

# === 工具比较 ===
# | 特性 | inferCNV | CopyKAT | SCEVAN |
# |------|----------|---------|--------|
# | 需要参考细胞 | 是 | 可选 | 否 |
# | 自动肿瘤/正常分类 | 否 | 是 | 是 |
# | 亚克隆检测 | 是(HMM) | 是(聚类) | 是 |
# | 计算速度 | 慢 | 中 | 快 |
# | HMM状态预测 | 是 | 否 | 是 |
# | 所需细胞数 | >100 | >200 | >50 |
# | 文献引用数 | 最多 | 较多 | 较少 |

# 最佳实践建议：
# 1. 用CopyKAT快速区分肿瘤/正常
# 2. 用inferCNV做精细的亚克隆分析
# 3. 多工具交叉验证提高可靠性
# 4. 如有配对bulk数据，做一致性验证

实战命令速查

# inferCNV快速命令
infercnv_obj <- CreateInfercnvObject(raw_counts_matrix, annotations_file,
                                      gene_order_file, ref_group_names)
infercnv_obj <- infercnv::run(infercnv_obj, cutoff=0.1, out_dir="output",
                               denoise=TRUE, HMM=TRUE, num_threads=16)

# CopyKAT快速命令
results <- copykat(rawmat=counts, id.type="S", n.cores=16)

# SCEVAN快速命令
results <- pipelineCNA(count_matrix, sample="sample1", par_cores=16, SUBCLONES=TRUE)

面试常问点

Q1: 从scRNA-seq推断CNV的基本假设是什么？局限性在哪里？

A: 基本假设是基因表达量与DNA拷贝数正相关——扩增区域基因表达上调，缺失区域下调。局限性：(1) 基因表达受多因素调控（表观遗传、转录因子），不完全由CN决定；(2) 分辨率低（需滑动窗口平滑，不能精确到单基因）；(3) 对低表达区域（如异染色质）无法推断；(4) 无法检测拷贝中性的LOH。

Q2: inferCNV中参考细胞如果选错了会怎样？

A: 如果参考细胞本身含有CNV（如误将肿瘤细胞选为参考），则肿瘤细胞的推断CNV会被"抵消"——该扩增区域可能不再显示为扩增。反之，正常细胞可能被推断出虚假的CNV。建议使用高置信度注释的免疫细胞作为参考，并验证参考细胞在已知频繁CNV区域的表达是否正常。

Q3: CopyKAT如何自动区分肿瘤和正常细胞？

A: CopyKAT先将细胞分成小层次聚类簇，用Gaussian mixture model（GMM）计算各簇的方差，方差最小的簇被认定为二倍体参考细胞。然后以此为基线，用贝叶斯分割（Poisson-gamma模型+MCMC）推断所有细胞的CNV profile，再对CNV矩阵做层次聚类。非整倍体（aneuploid）细胞有明显的CNV波动，二倍体（diploid）细胞趋于平坦，通过聚类距离或GMM分布检验分离两类细胞。

Q4: 基于scRNA推断的CNV如何验证？

A: (1) 与同一样本的bulk WGS/WES或SNP array CNV结果比较一致性；(2) 检查已知的组织特异CNV是否被正确检测（如GBM中chr7 gain/chr10 loss）；(3) 验证正常细胞（immune/stroma）是否确实没有推断出CNV；(4) 多工具交叉验证（inferCNV + CopyKAT + SCEVAN取一致结果）。

Q5: 如何利用CNV推断结果做亚克隆分析？

A: 将肿瘤细胞的CNV矩阵进行聚类（层次聚类或k-means），各cluster代表不同的亚克隆。同一亚克隆的细胞共享相同的大尺度CNV模式。可以进一步分析各亚克隆的差异基因表达、通路活性差异，以及用CNV pattern构建简单的进化树（基于共有/特有CNV事件的嵌套关系）。

易错点

1. 使用归一化数据而非原始counts

inferCNV和CopyKAT需要原始UMI counts作为输入，不要使用log-normalized或SCTransform后的数据。工具内部会做自己的归一化处理。

2. 参考细胞数量太少

参考细胞应有足够数量（建议>100-200个）以建立稳定的基线。太少的参考细胞会使基线不稳定，增加假阳性。

3. 未过滤低质量细胞

含有大量ambient RNA或doublet的细胞会干扰CNV推断。应在运行CNV分析之前完成严格的QC过滤。

4. 对正常组织scRNA数据运行得到虚假CNV

正常组织中不应有大面积CNV，如果inferCNV在正常数据中推断出"CNV"，说明参数或参考细胞设置有问题。应该用正常组织做sanity check。

5. 过度解读小区域的CNV信号

scRNA-CNV推断在大区域（整个染色体臂）最可靠，对小focal CNV（如单个基因扩增）灵敏度很低。不要过度解读小范围的信号波动。

补充知识

其他scRNA-CNV工具

  • HoneyBADGER：同时利用表达水平和等位基因信号
  • CaSpER：结合表达和BAF（B allele frequency）
  • Numbat：利用SNP信息的单细胞CNV+LOH推断

临床应用场景

  • 手术样本中区分残留肿瘤细胞和反应性基质
  • 判断脑胶质瘤的亚型（1p/19q共缺失 = 少突胶质细胞瘤）
  • 在组织微环境研究中排除肿瘤细胞干扰

引用推荐

  • inferCNV: Tirosh et al., Science, 2016
  • CopyKAT: Gao et al., Nature Biotechnology, 2021
  • SCEVAN: De Falco et al., Nature Communications, 2023
  • Numbat: Gao et al., Nature Biotechnology, 2022

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