非靶向代谢组学LC-MS分析¶

一句话说明¶

非靶向代谢组学LC-MS分析就是"先把样品里所有能检测到的小分子代谢物都捞出来，再看看哪些有意思"——不预设目标，广撒网式地寻找差异代谢物。

核心知识点¶

要点1：LC-MS基本原理¶

• LC（液相色谱）：按化学性质把代谢物分开，就像赛跑——不同分子跑得快慢不同（出峰时间不同）
• MS（质谱）：给每个分子"称体重"（测质荷比m/z），就像给每个人一个身份标签
• 串联质谱（MS/MS）：把分子打碎再称碎片重量，相当于"看指纹"确认身份
• 正/负离子模式：正离子模式检测容易加H+的分子（胺类、生物碱），负离子模式检测容易丢H+的分子（有机酸、脂肪酸）

要点2：实验设计关键点¶

• 样本量：每组至少6个生物学重复，推荐10-20个
• QC策略：每5-10个样本插入1个Pooled QC
• 随机化：进样顺序必须随机，避免批次效应
• 空白样本：溶剂空白+提取空白，用于扣除背景信号
• 色谱柱选择：反相C18（检测中等极性到非极性代谢物）、HILIC（检测极性代谢物）

要点3：数据处理软件¶

• XCMS（R/Bioconductor）：开源经典，学术界最常用
• MZmine 3：Java开源GUI工具，操作友好
• MS-DIAL：支持DIA数据，自带谱库匹配
• Compound Discoverer：Thermo官方商业软件
• 处理步骤：峰检测 → 峰对齐 → 峰填补 → 特征表导出

要点4：代谢物注释分级¶

• Level 1：与标准品比对（保留时间+MS/MS完全匹配）——最高置信度
• Level 2：与谱库MS/MS匹配（HMDB、MassBank、METLIN）
• Level 3：基于精确质量和分子式推测的候选化合物类别
• Level 4：未知但可重复检测的特征

实战代码¶

# === XCMS非靶向代谢组学处理流程 ===
library(xcms)       # 加载XCMS包
library(MSnbase)    # 质谱数据基础包

# 1. 读取mzML/mzXML原始数据文件
raw_files <- list.files("data/", pattern = ".mzML", full.names = TRUE)  # 列出所有mzML文件
raw_data <- readMSData(raw_files, mode = "onDisk")  # 以磁盘模式读取，节省内存

# 2. 峰检测（CentWave算法，适合高分辨质谱）
cwp <- CentWaveParam(
  peakwidth = c(5, 30),   # 峰宽范围5-30秒（根据色谱条件调整）
  ppm = 10,               # 质量偏差容忍度10ppm
  snthresh = 6,           # 信噪比阈值，低于6的峰不要
  noise = 1000            # 绝对噪音阈值
)
xdata <- findChromPeaks(raw_data, param = cwp)  # 执行峰检测

# 3. 峰对齐（Obiwarp算法）
obiwarp_param <- ObiwarpParam(binSize = 0.6)  # 对齐参数
xdata <- adjustRtime(xdata, param = obiwarp_param)  # 校正保留时间

# 4. 峰分组（把不同样本中同一个代谢物的峰归为一组）
pdp <- PeakDensityParam(
  sampleGroups = raw_data$group,  # 样本分组信息
  bw = 5,        # 带宽参数，控制分组严格程度
  minFraction = 0.5  # 至少50%的样本中出现才保留
)
xdata <- groupChromPeaks(xdata, param = pdp)  # 执行峰分组

# 5. 缺失值填补
xdata <- fillChromPeaks(xdata)  # 回到原始数据中重新积分缺失的峰

# 6. 导出特征表
feature_table <- featureValues(xdata, value = "into")  # 提取峰面积矩阵
write.csv(feature_table, "feature_table.csv")  # 保存为CSV

面试常问点¶

Q1: 非靶向和靶向代谢组学有什么区别？¶

参考答案：非靶向是"广撒网"——不预设检测什么，尽可能检测所有代谢物，适合发现新的差异代谢物，但定量不太准确。靶向是"精确打击"——提前确定要测哪些代谢物，用标准品定量，结果更准但覆盖面窄。一般先用非靶向发现候选代谢物，再用靶向验证。

Q2: 为什么要同时跑正离子和负离子模式？¶

参考答案：因为不同代谢物的电离特性不同。氨基酸、生物碱在正离子模式灵敏度更高；有机酸、脂肪酸、核苷酸在负离子模式更好。只跑一种模式会漏掉很多代谢物，两种模式互补才能覆盖更广的代谢物谱。

Q3: XCMS中CentWave的peakwidth参数怎么设？¶

参考答案：peakwidth定义了期望的色谱峰宽度范围（单位秒）。UHPLC一般设(5,30)，常规HPLC可能要设(10,60)。可以先看几个已知代谢物的色谱峰宽度来确定。设太窄会漏峰，设太宽会把噪音也当成峰。

速查卡片¶