850. 单分子测序前沿¶
一句话概述：单分子测序 = 直接读取单个DNA/RNA分子（不需要PCR扩增），消除了扩增偏差，实现真正的全长、直接、实时测序。
核心知识点速查表¶
| 平台 | 原理 | 读长 | 准确率 | 特色 |
|---|---|---|---|---|
| ONT MinION | 纳米孔电信号 | 超长(Mb级) | ~99%(最新) | 便携、实时 |
| ONT PromethION | 纳米孔(高通量) | 超长 | ~99% | 高通量 |
| PacBio Revio | ZMW荧光信号 | 10-25kb(HiFi) | >99.9% | 超高精度 |
| PacBio Vega | 新一代系统 | 10-25kb | >99.9% | 2024新平台 |
一、单分子测序的核心优势¶
传统NGS（Illumina）：
DNA → 打断 → PCR扩增(产生偏差) → 测序(短读长) → 拼接
单分子测序：
DNA → 直接测序(无PCR) → 长读长
具体优势：
1. 无PCR偏差 → GC含量极端区域也能准确测
2. 长读长 → 跨越重复区域，完整基因组组装
3. 直接检测修饰 → DNA甲基化、RNA修饰(m6A)
4. 实时(ONT) → 边测边看结果
5. 全长转录本 → 不需要拼接就能获得完整mRNA
二、应用场景与分析¶
# 单分子测序核心应用
# 1. 完整基因组组装(T2T级别)
hifiasm -o asm \ # HiFi组装
hifi_reads.fq.gz # PacBio HiFi数据
# 结合ONT超长读长进一步改进
# 2. 结构变异检测
cuteSV aligned.bam ref.fa \ # 结构变异检测
sv_output.vcf \ # 输出VCF
work_dir/ \ # 工作目录
--threads 16 \ # 线程
--min_support 3 # 最少支持reads
# 3. 全长转录组(Iso-Seq)
isoseq3 cluster \ # 聚类全长转录本
flnc.bam \ # 全长非嵌合reads
clustered.bam # 聚类输出
# 4. 表观遗传修饰直接检测
modkit pileup \ # ONT甲基化分析
aligned.bam \ # 含修饰信息的BAM
methylation.bed \ # 输出BED
--ref ref.fa # 参考基因组
三、面试高频问题¶
Q: 单分子测序和NGS的核心区别？ A: 无PCR扩增（消除偏差）、长读长（完整基因组）、可直接检测碱基修饰。代价是通量较低、单碱基准确率较NGS低（PacBio HiFi已解决）。
Q: 什么时候用单分子测序而不是Illumina？ A: 需要完整基因组组装、结构变异检测、全长转录本、甲基化直接检测时。短变异检测、RNA定量等仍以Illumina为主。