753. 外显子组WES分析流程¶

一句话概述：只测基因组中编码蛋白的部分（~1-2%），成本低但能找到大部分致病突变——就像只检查一本书的"目录和正文"，忽略空白页，效率高但可能遗漏非编码区的重要信息。

核心知识点速查表¶

概念	WGS	WES
覆盖区域	全基因组(3Gb)	外显子组(~60Mb)
测序成本	高	低(WGS的1/3)
测序深度	通常30-50x	通常100-200x
能检测的变异	SNV+Indel+SV+CNV	SNV+Indel(外显子区)
非编码变异	能检测	无法检测
适用场景	全面分析	临床诊断/大队列

一、WES vs WGS的选择¶

WES额外需要一个target BED文件（捕获区域坐标）。其余流程与WGS相似，但有几个关键差异。

二、WES特有的分析步骤¶

# WES与WGS的主要差异步骤

# 1. 使用capture区域限制变异检测
TARGET_BED="/data/reference/agilent_v7_targets.bed"  # 捕获区域文件

# HaplotypeCaller只在target区域检测
gatk HaplotypeCaller \
  -R ${REF} \
  -I ${SAMPLE}.recal.bam \
  -L ${TARGET_BED} \  # 关键！限制到target区域
  -O ${SAMPLE}.g.vcf.gz \
  -ERC GVCF \
  --native-pair-hmm-threads 8

# 2. 计算on-target率（质控指标）
bedtools intersect \
  -a ${SAMPLE}.dedup.bam \  # 输入BAM
  -b ${TARGET_BED} \  # target区域
  -bed -wa | wc -l  # 统计落在target上的reads数

# 3. 计算target区域的覆盖度
gatk CollectHsMetrics \
  -R ${REF} \
  -I ${SAMPLE}.dedup.bam \
  -BAIT_INTERVALS ${TARGET_BED%.bed}.interval_list \  # 捕获诱饵区域
  -TARGET_INTERVALS ${TARGET_BED%.bed}.interval_list \  # 目标区域
  -O ${SAMPLE}.hs_metrics.txt  # 输出覆盖度统计

# 关键指标：
# MEAN_TARGET_COVERAGE: target区平均覆盖度(通常>100x)
# PCT_TARGET_BASES_20X: 覆盖度≥20x的target碱基比例(>95%)
# ON_BAIT_PCT: 落在bait上的reads比例(通常>60%)

三、常见报错与解决¶

报错信息	原因	解决方案
`Low on-target rate`	捕获效率差	检查文库制备质量
`Uneven coverage`	某些外显子GC偏差大	GC校正或增加测序深度
`BED format error`	BED文件格式问题	确认是0-based坐标
`Missing exons`	BED文件不包含目标基因	更新capture kit的BED文件

四、面试高频问题¶

Q1: WES能检测到结构变异吗？¶

A: WES对大的SV检测能力很弱（断点通常在非编码区），但可以检测外显子区域的小indel和CNV。对于SV分析，WGS是更好的选择。

Q2: 为什么WES要用更高的测序深度？¶

A: ①WES覆盖区域小，测更深的性价比高；②捕获过程引入不均匀性，需要更高深度补偿；③临床应用需要高置信度（低频变异检测需要高深度）。

五、速查表¶

# WES核心差异（相比WGS）
# 1. 变异检测加 -L target.bed
# 2. 质控加 CollectHsMetrics
# 3. 过滤用硬过滤（样本少时不适合VQSR）
# 4. 注释时关注编码区变异

# 质控标准
# on-target rate > 60%
# mean target coverage > 100x
# PCT_TARGET_BASES_20X > 95%