生信面试 NGS 测序原理题¶

文库制备 → 桥式PCR(Bridge PCR) → 边合成边测序(SBS) → 信号检测

详细步骤：
1. DNA打断 → 200-500bp片段
2. 末端修复 + 加A尾 + 连接接头(adapter)
3. 片段固定到flowcell表面
4. 桥式PCR扩增 → 形成数百万个"簇"(cluster)
   每个簇 = 同一片段的~1000个拷贝（信号放大）
5. 边合成边测序(SBS):
   - 加入4种荧光标记的dNTP（可逆终止子）
   - 每次只掺入1个碱基
   - 拍照记录荧光颜色（哪个碱基）
   - 切掉荧光标记和终止基团
   - 重复上述步骤~150次 = 150bp read
6. 如果是双端测序(Paired-End):
   - 先从一端测150bp（Read 1）
   - 翻转后从另一端测150bp（Read 2）
   - 得到 PE150 数据（2×150bp）

核心：单分子实时测序(SMRT)

1. DNA环化（加接头形成环状模板 SMRTbell）
2. 聚合酶固定在零模波导(ZMW)底部
3. 聚合酶合成新链时，掺入荧光dNTP
4. 实时记录荧光信号
5. 环状模板可以多次环绕测序（CCS模式提高准确率）

优势：
- 读长极长（平均15-20kb，最长>100kb）
- CCS模式准确率>99.9%（Q40+）
- 能检测碱基修饰（甲基化）
- 无GC偏好（无PCR扩增步骤）

劣势：
- 通量相对低，成本高
- 单次pass错误率~10-15%（CCS可纠正）

核心：蛋白纳米孔检测电流变化

1. DNA链穿过蛋白纳米孔
2. 不同碱基阻断电流的程度不同
3. 实时检测电流变化 → 推断碱基序列

优势：
- 读长最长（理论无上限，记录>4Mb）
- 设备便携（MinION只有U盘大小）
- 实时数据输出（可边测边分析）
- 能直接检测碱基修饰

劣势：
- 单次准确率~95-98%（持续提高中）
- 系统误差模式与Illumina不同（主要是同聚物）

@SRR12345_1 1:N:0:ATCACG          ← 第1行：序列ID（@开头）
ATCGATCGATCGATCGATCG                ← 第2行：碱基序列
+                                    ← 第3行：分隔符（+）
FFFFFFFFFFF:FFFFF:FFF               ← 第4行：质量值（ASCII编码）

质量值说明（Phred+33编码）：
字符 → ASCII码 - 33 = Phred质量值
'F' → 70 - 33 = 37 (Q37, 错误率0.02%)
'?' → 63 - 33 = 30 (Q30, 错误率0.1%)
'5' → 53 - 33 = 20 (Q20, 错误率1%)
'!' → 33 - 33 = 0  (Q0, 50%错误率)

Q = -10 × log10(P_error)
Q20 → P=0.01 → 99%准确
Q30 → P=0.001 → 99.9%准确
Q40 → P=0.0001 → 99.99%准确

SAM格式核心字段（11个必须字段）：
QNAME  FLAG  RNAME  POS  MAPQ  CIGAR  RNEXT  PNEXT  TLEN  SEQ  QUAL

字段说明：
1. QNAME — Read名字
2. FLAG  — 标志位（比对信息编码）
   - 0x4 (4)   = 未比对上
   - 0x10 (16) = 反向互补比对
   - 0x40 (64) = Read1
   - 0x80 (128)= Read2
   - 0x100(256)= 次要比对
   - 0x400(1024)= PCR重复
3. RNAME — 参考序列名(如chr1)
4. POS   — 比对起始位置（1-based）
5. MAPQ  — 比对质量（0-60, 60最好）
6. CIGAR — 比对情况编码
   - 50M = 50个碱基匹配
   - 3I = 3个碱基插入
   - 2D = 2个碱基缺失
   - 5S = 5个碱基软裁剪
   例: 50M2I30M = 50bp匹配+2bp插入+30bp匹配
7-8. RNEXT/PNEXT — 配对read的位置信息
9. TLEN — 片段长度
10. SEQ — 碱基序列
11. QUAL — 碱基质量

BAM = SAM的二进制压缩版（小5-10倍）
CRAM = 比BAM更高压缩（参考基因组编码）

VCF格式（变异调用结果）：
##fileformat=VCFv4.2                  ← 元数据行（##开头）
##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer>  ← 字段定义
#CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT SAMPLE  ← 表头
chr1   100 .  A   T   50   PASS   DP=30  GT:AD  0/1:15,15  ← 数据行

关键字段：
- CHROM: 染色体
- POS: 位置（1-based）
- REF: 参考等位基因
- ALT: 变异等位基因
- QUAL: 变异质量
- FILTER: 过滤状态（PASS=通过）
- INFO: 附加信息（DP=深度等）
- GT: 基因型（0/0=纯合参考, 0/1=杂合, 1/1=纯合变异）
- AD: 等位基因深度（如15,15 = ref 15reads, alt 15reads）

BED格式（区间文件）：
chr1  100  200  gene_name  score  strand
注意：BED是0-based半开区间 [100, 200)
VCF是1-based

# ========== 质控工具和标准 ==========

# FastQC 质控报告解读
fastqc sample_R1.fastq.gz -o qc_results/  # 运行FastQC

# 关键指标和判断标准：
# 1. 碱基质量分布(Per base quality)
#    Q30以上 = 好（绿色区域）
#    Q20以下 = 差（红色区域）
#    Read末端质量下降是正常的

# 2. 序列质量分布(Per sequence quality)
#    峰值在Q30以上 = 好
#    双峰分布 = 可能有污染

# 3. GC含量分布(Per sequence GC content)
#    应该呈正态分布
#    多峰 = 可能有接头污染或其他物种污染

# 4. 序列长度分布(Sequence Length Distribution)
#    应该集中在标称长度（如150bp）

# 5. 接头含量(Adapter Content)
#    >5% = 需要去接头

# 6. 重复序列(Sequence Duplication Levels)
#    RNA-seq有较高重复率是正常的
#    WGS重复率高需要去重

# fastp — 一步完成质控+过滤+去接头
fastp \
    -i R1.fastq.gz \                       # Read1输入
    -I R2.fastq.gz \                       # Read2输入
    -o R1.clean.fq.gz \                    # Read1输出
    -O R2.clean.fq.gz \                    # Read2输出
    -q 20 \                                # 碱基质量阈值(Q20)
    -l 50 \                                # 最短read长度
    --detect_adapter_for_pe \              # 自动检测PE接头
    -w 8 \                                 # 线程数
    -j report.json \                       # JSON报告
    -h report.html                         # HTML报告

BWA-MEM 比对流程：
1. 建索引：bwa index ref.fa
   → 构建 BWT + FM-index（约需参考基因组大小的内存）

2. 种子查找(Seeding)：
   → 从read中提取短种子（~19bp）
   → 用FM-index在参考基因组中精确定位（O(m)时间）
   → 允许种子间有间隔（MEMs = Maximal Exact Matches）

3. 种子链接(Chaining)：
   → 把在参考基因组上位置相近的种子链接起来
   → 形成候选比对区域

4. Smith-Waterman延伸(Extension)：
   → 在候选区域做局部比对
   → 使用仿射gap罚分（开gap罚分 + 延伸gap罚分）
   → 输出CIGAR字符串记录比对细节

比对后处理：
5. 排序: samtools sort → 按坐标排序
6. 去重: picard MarkDuplicates → 标记PCR重复
7. 建索引: samtools index → 建立.bai索引

# 完整比对流程
bwa mem -t 8 -R '@RG\tID:sample1\tSM:sample1\tPL:ILLUMINA' \
    reference.fa R1.fq.gz R2.fq.gz \   # 参考基因组 + PE reads
    | samtools sort -@ 4 -o sorted.bam  # 排序

samtools index sorted.bam               # 建索引

# 去重
gatk MarkDuplicates \
    -I sorted.bam \
    -O dedup.bam \
    -M dedup_metrics.txt \
    --REMOVE_DUPLICATES false           # 标记但不删除

GATK HaplotypeCaller 原理：
1. 活跃区域检测(Active Region Detection)
   → 扫描基因组，找到reads比对"不正常"的区域
   → 正常区域直接跳过（节省时间）

2. 局部重新组装(Local De Novo Assembly)
   → 在活跃区域构建de Bruijn图
   → 找到所有可能的单倍型(haplotype)

3. Pair-HMM
   → 计算每条read来自每种单倍型的概率
   → 使用配对隐马尔可夫模型(Pair-HMM)

4. 基因型推断(Genotyping)
   → 贝叶斯方法计算每种基因型的后验概率
   → 输出基因型(GT)和基因型质量(GQ)

体细胞变异(Mutect2)与胚系变异(HC)的区别：
- HC假设基因型是0/0, 0/1, 1/1之一（二倍体模型）
- Mutect2不假设二倍体，允许任意VAF（肿瘤是异质的）
- Mutect2需要配对的正常样本来过滤胚系变异

# ========== 深度与覆盖度计算 ==========

# 理论覆盖度 = (reads数 × read长度) / 基因组大小
# 例：1亿条150bp reads, 人类基因组3Gb
coverage = (100_000_000 * 150) / 3_000_000_000   # = 5X

# 不同应用的推荐深度：
recommended_depth = {
    "WGS 胚系变异": "30-50X",          # 标准WGS
    "WGS 体细胞变异": "60-100X(肿瘤) + 30X(正常)",
    "WES": "100-200X",                  # 外显子组
    "RNA-seq": "20-50M reads/样本",     # 按reads数算不按X
    "ChIP-seq": "10-30M reads",
    "ATAC-seq": "50M reads",
    "ctDNA液体活检": ">10000X(原始)",
    "16S扩增子": "10000-100000 reads/样本",
    "宏基因组WGS": "10-50M PE reads/样本",
}

# 覆盖度影响变异检测的灵敏度：
# 30X → 检测>20% VAF的变异（杂合突变）
# 100X → 检测>5% VAF的变异（亚克隆）
# 1000X → 检测>0.5% VAF的变异（ctDNA）
# 10000X → 检测>0.1% VAF的变异（UMI ctDNA）

# === NGS原理速查 ===

# 测序平台比较
# Illumina: 短读长(150-300bp), 高通量, 低错误率(~0.1%), SBS原理
# PacBio:   长读长(15-20kb), CCS准确率99.9%, SMRT原理
# ONT:      超长读长(>100kb), 实时测序, 纳米孔原理, 准确率~98%

# 文件格式
# FASTQ: 原始测序数据（序列+质量）
# SAM/BAM: 比对结果（BAM是二进制压缩）
# VCF: 变异调用结果
# BED: 基因组区间（0-based）
# GFF/GTF: 基因注释

# 标准分析流程
# FASTQ → FastQC/fastp(质控) → BWA(比对) → samtools sort(排序)
# → MarkDuplicates(去重) → BQSR(质量校正) → HaplotypeCaller(变异检测)

# Phred质量值
# Q20 = 99%准确率 = 1%错误
# Q30 = 99.9%准确率 = 0.1%错误
# Q40 = 99.99%准确率 = 0.01%错误

# 推荐覆盖度
# WGS: 30X | WES: 100X | RNA-seq: 20M reads