质谱数据处理MaxQuant¶

质谱蛋白质组学流程（像破案一样）：

样品准备阶段：
  蛋白质混合物 → 酶切成肽段 → 就像把一本书撕成碎片

质谱检测阶段：
  LC-MS/MS检测：
  ├── LC（液相色谱）= 把碎片按大小排队
  ├── MS1（一级质谱）= 称每个碎片的重量
  └── MS2（二级质谱）= 把碎片再打碎，看指纹

数据分析阶段（MaxQuant做的事）：
  ├── 1. 读取RAW文件（原始数据）
  ├── 2. 提取MS2谱图
  ├── 3. 数据库搜索（把碎片指纹和数据库比对）
  ├── 4. 肽段鉴定（确认这个碎片来自哪个蛋白质）
  ├── 5. 蛋白质组装（把碎片拼回完整的蛋白质）
  ├── 6. 定量分析（比较不同样品中蛋白质多少）
  └── 7. FDR控制（排除假阳性）

# ========== Windows安装（推荐） ==========
# 1. 下载MaxQuant：https://www.maxquant.org/maxquant/
# 2. 解压zip文件到任意目录
# 3. 需要安装 .NET Framework 4.7.2+

# ========== Linux安装（通过Mono运行） ==========
# 安装Mono运行时
sudo apt-get install mono-complete  # Ubuntu/Debian系统安装Mono

# 下载MaxQuant
wget https://www.maxquant.org/download_asset/maxquant/latest  # 下载最新版
unzip MaxQuant_*.zip -d ~/software/MaxQuant  # 解压

# 运行MaxQuant（命令行模式）
mono ~/software/MaxQuant/bin/MaxQuantCmd.exe mqpar.xml  # 用Mono运行

# ========== 验证安装 ==========
# Windows: 双击MaxQuant.exe
# Linux: mono MaxQuantCmd.exe --help

# 从UniProt下载蛋白质数据库
# 人类蛋白质组（推荐用reviewed的Swiss-Prot）

# 下载人类Swiss-Prot蛋白质组
wget "https://rest.uniprot.org/uniprotkb/stream?format=fasta&query=reviewed:true+AND+organism_id:9606" \
    -O human_swissprot.fasta  # 下载人类已审核蛋白质序列

# 查看序列数量
grep -c "^>" human_swissprot.fasta  # 统计蛋白质数量（约20,000+）

# 同时下载常见污染物数据库
wget https://www.maxquant.org/contaminants  # MaxQuant自带污染物数据库
# 或使用CRAPome数据库

<?xml version="1.0" encoding="utf-8"?>
<!-- MaxQuant参数配置文件 -->
<MaxQuantParams>
  <!-- 原始数据文件路径 -->
  <filePaths>
    <string>D:\data\sample1.raw</string>  <!-- 样品1的RAW文件 -->
    <string>D:\data\sample2.raw</string>  <!-- 样品2的RAW文件 -->
    <string>D:\data\sample3.raw</string>  <!-- 样品3的RAW文件 -->
  </filePaths>

  <!-- 实验设计 -->
  <experiments>
    <string>Control</string>   <!-- 对照组 -->
    <string>Treatment</string> <!-- 处理组 -->
    <string>Treatment</string> <!-- 处理组（重复） -->
  </experiments>

  <!-- 蛋白质数据库 -->
  <fastaFiles>
    <string>D:\database\human_swissprot.fasta</string>  <!-- FASTA数据库路径 -->
  </fastaFiles>

  <!-- 搜索参数 -->
  <enzymes>
    <string>Trypsin/P</string>  <!-- 酶切方式：胰蛋白酶 -->
  </enzymes>
  <maxMissedCleavages>2</maxMissedCleavages>  <!-- 最多允许2个漏切 -->

  <!-- 质量精度 -->
  <mainSearchTol>4.5</mainSearchTol>  <!-- MS1质量容差：4.5 ppm -->
  <msmsSearchTol>20</msmsSearchTol>    <!-- MS2质量容差：20 ppm -->

  <!-- 修饰设置 -->
  <fixedModifications>
    <string>Carbamidomethyl (C)</string>  <!-- 固定修饰：半胱氨酸烷基化 -->
  </fixedModifications>
  <variableModifications>
    <string>Oxidation (M)</string>          <!-- 可变修饰：甲硫氨酸氧化 -->
    <string>Acetyl (Protein N-term)</string> <!-- 可变修饰：蛋白质N端乙酰化 -->
  </variableModifications>

  <!-- LFQ定量 -->
  <lfqMode>1</lfqMode>  <!-- 启用LFQ定量（1=开启） -->
  <lfqMinRatioCount>2</lfqMinRatioCount>  <!-- LFQ最少肽段数 -->

  <!-- FDR控制 -->
  <peptideFdr>0.01</peptideFdr>   <!-- 肽段FDR：1% -->
  <proteinFdr>0.01</proteinFdr>   <!-- 蛋白质FDR：1% -->

  <!-- 线程数 -->
  <numThreads>8</numThreads>  <!-- 使用8个CPU线程 -->
</MaxQuantParams>

# Windows命令行运行
MaxQuantCmd.exe mqpar.xml  # 用配置文件运行MaxQuant

# Linux (Mono)
mono MaxQuantCmd.exe mqpar.xml  # 用Mono运行MaxQuant

# 查看进度
tail -f combined/proc/progress.txt  # 实时查看进度

# MaxQuant输出目录结构
combined/txt/                   # 主要结果文件夹
├── proteinGroups.txt          # 蛋白质鉴定和定量结果（最重要！）
├── peptides.txt               # 肽段鉴定结果
├── evidence.txt               # 每个肽段的详细证据
├── msms.txt                   # MS/MS谱图匹配结果
├── msmsScans.txt              # MS/MS扫描信息
├── modificationSpecificPeptides.txt  # 修饰肽段
├── summary.txt                # 运行摘要
└── parameters.txt             # 使用的参数

# 查看蛋白质鉴定数（不含反库和污染物）
awk -F'\t' 'NR>1 && $0!~/^REV__/ && $0!~/^CON__/' combined/txt/proteinGroups.txt | wc -l

#!/usr/bin/env python3
"""解析MaxQuant输出结果"""

import pandas as pd  # 数据处理
import numpy as np  # 数值计算

# ========== 读取proteinGroups.txt ==========
df = pd.read_csv(
    "combined/txt/proteinGroups.txt",
    sep="\t",  # Tab分隔
    low_memory=False  # 避免内存警告
)
print(f"原始蛋白质组数: {len(df)}")  # 打印原始数量

# ========== 数据过滤（关键步骤！） ==========
# 1. 去除反库（Reverse）命中
df = df[df["Reverse"] != "+"]  # 排除反库匹配
print(f"去除Reverse后: {len(df)}")

# 2. 去除污染物（Contaminant）
df = df[df["Potential contaminant"] != "+"]  # 排除污染物蛋白
print(f"去除污染物后: {len(df)}")

# 3. 去除仅通过修饰位点鉴定的蛋白质
df = df[df["Only identified by site"] != "+"]  # 排除仅位点鉴定
print(f"最终蛋白质数: {len(df)}")

# ========== 提取LFQ定量数据 ==========
lfq_cols = [col for col in df.columns if col.startswith("LFQ intensity")]  # 找所有LFQ列
lfq_data = df[["Protein IDs", "Gene names", "Protein names"] + lfq_cols].copy()  # 提取关键列

# 将0替换为NaN（0表示未检测到）
for col in lfq_cols:
    lfq_data[col] = lfq_data[col].replace(0, np.nan)  # 0→NaN

# Log2转换（蛋白质组学标准操作）
for col in lfq_cols:
    lfq_data[f"log2_{col}"] = np.log2(lfq_data[col])  # 对LFQ值取log2

# ========== 基本统计 ==========
print(f"\n===== 蛋白质组学数据概况 =====")
print(f"鉴定的蛋白质总数: {len(lfq_data)}")
for col in lfq_cols:
    valid = lfq_data[col].notna().sum()  # 有效值数量
    print(f"  {col}: {valid} 个蛋白质有定量值 ({valid/len(lfq_data)*100:.1f}%)")

# 保存清理后的数据
lfq_data.to_csv("protein_lfq_cleaned.csv", index=False)  # 保存为CSV
print("\n清理后的数据已保存到 protein_lfq_cleaned.csv")

#!/usr/bin/env python3
"""使用Python实现Perseus风格的蛋白质组学分析"""

import pandas as pd  # 数据处理
import numpy as np  # 数值计算
from scipy import stats  # 统计分析
import matplotlib.pyplot as plt  # 绑图

# ========== 读取清理后的数据 ==========
df = pd.read_csv("protein_lfq_cleaned.csv")  # 读取数据

# 定义样品分组
control_cols = ["LFQ intensity Control_1", "LFQ intensity Control_2", "LFQ intensity Control_3"]  # 对照组
treatment_cols = ["LFQ intensity Treat_1", "LFQ intensity Treat_2", "LFQ intensity Treat_3"]  # 处理组

# ========== 缺失值过滤 ==========
# 至少在一个组的所有重复中都有值
def valid_in_group(row, cols, min_valid=2):
    """检查一组样品中有效值数量是否足够"""
    return row[cols].notna().sum() >= min_valid  # 至少min_valid个有效值

mask = df.apply(lambda r: valid_in_group(r, control_cols) or valid_in_group(r, treatment_cols), axis=1)
df_filtered = df[mask].copy()  # 过滤后的数据
print(f"过滤后蛋白质数: {len(df_filtered)}")

# ========== 缺失值填充 ==========
# 用正态分布随机值填充（Perseus默认方法）
all_values = []
for col in control_cols + treatment_cols:
    all_values.extend(np.log2(df_filtered[col].dropna()).tolist())

mean_val = np.mean(all_values)  # 全局均值
std_val = np.std(all_values)  # 全局标准差

# 从低端正态分布采样填充（模拟低丰度蛋白）
fill_mean = mean_val - 1.8 * std_val  # 下移1.8个标准差
fill_std = 0.3 * std_val  # 宽度为0.3倍标准差

for col in control_cols + treatment_cols:
    log2_col = np.log2(df_filtered[col])
    missing_mask = log2_col.isna()  # 找缺失值
    n_missing = missing_mask.sum()  # 缺失值数量
    df_filtered.loc[missing_mask, f"log2_{col}"] = np.random.normal(fill_mean, fill_std, n_missing)  # 随机填充
    df_filtered.loc[~missing_mask, f"log2_{col}"] = log2_col[~missing_mask]  # 保留原值

# ========== 差异分析（t检验） ==========
log2_ctrl = [f"log2_{c}" for c in control_cols]  # Log2对照组列名
log2_treat = [f"log2_{c}" for c in treatment_cols]  # Log2处理组列名

results = []
for idx, row in df_filtered.iterrows():  # 遍历每个蛋白质
    ctrl_vals = row[log2_ctrl].values.astype(float)  # 对照组值
    treat_vals = row[log2_treat].values.astype(float)  # 处理组值

    # t检验
    t_stat, p_val = stats.ttest_ind(treat_vals, ctrl_vals)  # 双样本t检验
    log2fc = np.mean(treat_vals) - np.mean(ctrl_vals)  # 计算log2倍数变化

    results.append({
        "gene": row.get("Gene names", ""),  # 基因名
        "protein": row.get("Protein IDs", ""),  # 蛋白质ID
        "log2FC": log2fc,  # log2倍数变化
        "pvalue": p_val,  # p值
        "-log10p": -np.log10(p_val) if p_val > 0 else 30  # -log10(p)
    })

result_df = pd.DataFrame(results)  # 转为DataFrame

# 多重检验校正（BH方法）
from statsmodels.stats.multitest import multipletests  # 多重检验校正
_, result_df["padj"], _, _ = multipletests(result_df["pvalue"].fillna(1), method="fdr_bh")  # BH校正

# ========== 火山图 ==========
plt.figure(figsize=(10, 8))  # 设置图片大小

# 分类：上调、下调、不显著
sig_up = (result_df["log2FC"] > 1) & (result_df["padj"] < 0.05)  # 显著上调
sig_down = (result_df["log2FC"] < -1) & (result_df["padj"] < 0.05)  # 显著下调
nonsig = ~(sig_up | sig_down)  # 不显著

plt.scatter(result_df.loc[nonsig, "log2FC"], result_df.loc[nonsig, "-log10p"],
            c="gray", alpha=0.5, s=10, label=f"Not Sig ({nonsig.sum()})")  # 不显著=灰色
plt.scatter(result_df.loc[sig_up, "log2FC"], result_df.loc[sig_up, "-log10p"],
            c="red", alpha=0.7, s=15, label=f"Up ({sig_up.sum()})")  # 上调=红色
plt.scatter(result_df.loc[sig_down, "log2FC"], result_df.loc[sig_down, "-log10p"],
            c="blue", alpha=0.7, s=15, label=f"Down ({sig_down.sum()})")  # 下调=蓝色

plt.axhline(-np.log10(0.05), color="gray", linestyle="--", alpha=0.5)  # p=0.05参考线
plt.axvline(1, color="gray", linestyle="--", alpha=0.5)  # log2FC=1参考线
plt.axvline(-1, color="gray", linestyle="--", alpha=0.5)  # log2FC=-1参考线

plt.xlabel("Log2 Fold Change", fontsize=14)  # X轴标签
plt.ylabel("-Log10 Adjusted P-value", fontsize=14)  # Y轴标签
plt.title("Volcano Plot - Proteomics", fontsize=16)  # 标题
plt.legend(fontsize=12)  # 图例
plt.tight_layout()
plt.savefig("volcano_proteomics.png", dpi=300, bbox_inches="tight")  # 保存图片
plt.close()
print("火山图已保存到 volcano_proteomics.png")

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质谱数据处理MaxQuant 速查表
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【安装】
Windows              → 解压即用，需.NET 4.7.2+
Linux                → Mono运行：mono MaxQuantCmd.exe

【关键参数】
酶切方式             → Trypsin/P（最常用）
漏切数               → 2（默认）
MS1容差              → 4.5 ppm（Orbitrap）
MS2容差              → 20 ppm
FDR                  → 1%（肽段和蛋白质都设1%）
固定修饰             → Carbamidomethyl (C)
可变修饰             → Oxidation (M), Acetyl (Protein N-term)

【核心输出文件】
proteinGroups.txt    → 蛋白质鉴定+定量（最重要）
peptides.txt         → 肽段鉴定
evidence.txt         → 肽段证据详情
summary.txt          → 运行摘要

【数据过滤（必做！）】
去反库               → Reverse ≠ "+"
去污染物             → Potential contaminant ≠ "+"
去仅位点鉴定         → Only identified by site ≠ "+"

【定量方法】
LFQ                  → 无标记定量（免费，最常用）
TMT/iTRAQ            → 同位素标记定量
SILAC                → 细胞培养同位素标记

【下游分析工具】
Perseus              → MaxQuant配套统计分析（GUI）
MSstats              → R包，蛋白质组统计分析
limma                → R包，差异分析

【面试考点】
Q: MaxQuant的Andromeda引擎是什么？
A: 内置的数据库搜索引擎，用打分算法匹配实验谱图和理论谱图

Q: FDR 1%是怎么控制的？
A: Target-Decoy策略：搜索反向数据库，统计假阳性比例

Q: LFQ定量的原理？
A: 基于同一肽段在不同样品中的色谱峰面积比值进行归一化定量
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