建库与测序实验设计（Library Preparation & Sequencing Design）¶

一句话说明¶

建库（Library Preparation）是把样本 DNA/RNA "改造"成测序仪能认识的标准格式的过程，而测序实验设计决定了用什么读长、多大深度、怎么混样——选错了方案，要么浪费钱，要么数据不够用。本篇讲的是"怎么建库、怎么设计测序方案"，和第13篇（测序平台原理）互补但不重复。

建库（Library Preparation）是什么（白话版）¶

一句话：建库就是把你提取出来的 DNA/RNA 加工成测序仪能"吃"的标准食物。

白话类比：

• 你的 DNA 原液好比一整头生猪 —— 测序仪不能直接吃
• 建库就是把猪切成标准大小的肉块（打断）→ 给每块肉串上签子（接头连接）→ 给每串肉贴上桌号标签（Index）→ 检查合不合格（质检）
• 最后把加工好的"标准烤串"送上测序仪这台"烤炉"

技术定义：建库是将核酸样本经过片段化、末端修复、接头连接、扩增和纯化等步骤，制备成带有平台特异性接头（Adapter）的 DNA 片段集合（Library），使其能被测序仪识别、扩增并测序的过程。

和第13篇的分工：第13篇讲的是测序仪内部怎么读碱基（SBS、SMRT、纳米孔电信号），本篇讲的是上机之前样本怎么处理、怎么设计测序方案。

DNA 建库流程详解（六步走）¶

以最常用的 Illumina DNA 建库（如 TruSeq DNA / Nextera Flex）为例：

第1步：DNA 片段化（Fragmentation）¶

目的：把长 DNA 分子打碎成测序仪能处理的短片段（通常 200-800 bp）。

白话解释： - 超声波打断 → 像用碎石机把大石头均匀砸碎，碎得比较随机，大小均匀 - 酶切打断（Tn5 转座酶）→ 像用一把有偏好的剪刀，剪得快但某些花纹的地方更容易下刀

片段大小选择： - WGS（全基因组测序）：300-500 bp（常见） - 宏基因组：300-500 bp - PCR-free 建库：350-450 bp（更窄，要求更严格）

第2步：末端修复 + 加 A 尾（End Repair + A-tailing）¶

为什么需要：DNA 打碎后断口是参差不齐的（有的是平头、有的是突出头），而接头连接需要整齐的末端。

打断后的 DNA 片段（断口不整齐）：

  5'---ATCGGA        ← 突出
     TAGCC---5'

         ↓ 末端修复（End Repair）

  5'---ATCGGA---3'   ← 补平（平末端，Blunt End）
  3'---TAGCCT---5'

         ↓ 加 A 尾（A-tailing）

  5'---ATCGGAA---3'  ← 3' 端多加一个 A
  3'---TAGCCT ---5'

白话解释： - 末端修复 → 把参差不齐的断口用砂纸磨平 - 加 A 尾 → 在磨平的一端涂上胶水（A 碱基），和接头上的 T 碱基配对黏合，像魔术贴的公母扣

关键酶：T4 DNA 聚合酶（补平）+ Klenow 片段（加 A）+ T4 PNK（磷酸化 5' 端）。现在很多试剂盒把这几步合成一管酶，一步完成。

第3步：接头连接（Adapter Ligation）¶

这是建库最核心的一步——给 DNA 片段两端接上"通用插头"，让测序仪能识别。

接头结构（以 Illumina Y 型接头为例）：

     P5 Adapter                    P7 Adapter
  ┌────────────┐               ┌────────────┐
  │ P5 序列    │               │ Index (i7) │
  │ Rd1 SP     │               │ Rd2 SP     │
  │     T 悬挂 │───DNA片段───│ T 悬挂     │
  └────────────┘               │ P7 序列    │
                                └────────────┘

各部分功能：
- P5 / P7 序列：和 Flow Cell 表面的互补寡核苷酸结合，让片段"粘"在芯片上
- Rd1 SP / Rd2 SP：测序引物结合位点（Read 1 / Read 2 的测序从这里起始）
- Index (i7 / i5)：样本标签序列（用于多样本混合后拆分数据，详见后文）
- T 悬挂：和 DNA 片段的 A 尾配对，实现定向连接

白话解释：接头就像 USB 接口——不管你内部存了什么数据（不同样本的 DNA），外面的插头形状是标准的，测序仪这台电脑才能识别。

连接效率的影响因素： - 接头与 DNA 片段的摩尔比（通常接头过量 10-100 倍） - 连接酶活性（T4 DNA Ligase） - 温度和时间（通常 20°C、15-30 分钟）

第4步：PCR 扩增（Library Amplification）¶

目的：把连接好接头的文库分子复制多份，增加文库总量（尤其是起始 DNA 量少的时候）。

PCR 循环数选择：
- 起始量充足（>100ng）：4-6 个循环，甚至 PCR-free（零循环）
- 起始量中等（10-100ng）：6-8 个循环
- 起始量低（<10ng）：8-12 个循环
- 超低量（单细胞、FFPE）：12-15 个循环

循环数越多 → 扩增偏差越大（GC 偏差加重、PCR duplicates 增多）

为什么 PCR-free 是趋势： - PCR 扩增会引入偏差：高 GC / 低 GC 区域扩增效率不同 - PCR 会产生 duplicates（完全一样的片段不是独立取样，而是同一分子的拷贝），会浪费测序资源 - Illumina 的 PCR-free 试剂盒（如 Illumina DNA Prep, PCR-free）跳过这步，但需要较多起始 DNA（>100ng）

白话解释：PCR 扩增像用复印机复印考卷——复印几份还行，复印太多次字迹就模糊了（偏差增大），而且复印出来的卷子不算独立答题（PCR duplicates）。

第5步：纯化与片段大小选择（Purification & Size Selection）¶

目的：去除接头二聚体（adapter dimer，两个接头自己连在一起没有 DNA 插入片段）、引物残留、酶等杂质，并选择目标大小范围的片段。

磁珠比例速记（AMPure XP）： - 0.6× 比例：回收 >500bp 片段（去掉小片段和接头二聚体） - 0.8× 比例：回收 >300bp 片段（最常用） - 1.0× 比例：回收 >200bp 片段 - 双面选择（double-sided）：先用低比例去大片段，再用高比例回收目标范围（如先 0.6× 去大的，再 0.8× 收中间的）

白话解释：磁珠纯化像用不同目数的筛子筛沙——大颗粒（长片段）先被筛掉，小颗粒（接头二聚体）从最细的筛子漏掉，留下中间合适大小的"砂粒"。

第6步：文库质检（Library QC）¶

建好的文库上机之前必须检查三件事：浓度、片段大小分布、有效文库浓度。

为什么不只用 Qubit：

Qubit 测的是所有 dsDNA 的总浓度，包括：
  ✓ 正常的文库分子（带接头、有插入片段）
  ✗ 接头二聚体（没用的废物）
  ✗ 没有接头的 DNA 片段（上不了机）

qPCR 定量只测带有 P5+P7 接头的分子 → 才是真正能被测序的"有效分子"

所以最佳实践是：Qubit 粗测 → Bioanalyzer 看片段分布 → qPCR 精确定量

白话解释：Qubit 像称体重（不管肌肉还是脂肪），Bioanalyzer 像照 X 光片（看骨架结构），qPCR 像体检量肌肉量（只算有用的部分）。

RNA 建库的特殊步骤¶

RNA 建库和 DNA 建库的核心区别：RNA 不能直接建库上机，必须先处理成 cDNA。

RNA 建库 vs DNA 建库的关键差异¶

DNA 建库：  提取 DNA → 打断 → 末端修复 → 接头连接 → PCR → 质检
RNA 建库：  提取 RNA → ★rRNA去除/polyA富集 → ★RNA片段化 → ★逆转录(cDNA) → 二链合成 → 末端修复 → 接头连接 → PCR → 质检
                       ↑ 这三步是 RNA 建库独有的 ↑

rRNA 去除 vs polyA 富集（二选一）¶

这是 RNA-seq 建库的第一个关键决策：

白话解释： - polyA 富集 → 像在鱼塘里专门用"mRNA 鱼钩"钓 mRNA 这种鱼，其他鱼不管 - rRNA 去除 → 像把鱼塘里数量最多的"rRNA 杂鱼"全捞走，剩下的各种鱼都要

逆转录（Reverse Transcription）¶

RNA → cDNA 的关键步骤：

        逆转录酶（Reverse Transcriptase）
mRNA  ───────────────────────────────→  cDNA第一链
        ↓ 用随机引物（Random Hexamers）或 Oligo-dT 引物启动

cDNA第一链  ───→  DNA 聚合酶  ───→  双链 cDNA
                                      ↓
                                后续步骤和 DNA 建库一样

链特异性建库（Strand-specific / Directional RNA-seq）： - 现在主流的 RNA-seq 建库都是链特异性的（如 Illumina TruSeq Stranded） - 方法：在合成 cDNA 第二链时掺入 dUTP 代替 dTTP，后续用 UDG 酶消化含 dU 的链 → 只保留第一链方向的信息 - 为什么重要：知道 RNA 来自基因组的正义链还是反义链，能准确判断转录方向，区分正义/反义转录本、重叠基因 - 白话说：不保留链信息就像只知道"这条路上有车"但不知道车往哪个方向开

宏基因组建库的特殊注意事项¶

宏基因组样本（如粪便、土壤、水体）和普通单物种基因组的建库有几个关键不同：

1. DNA 提取是最大的偏差来源¶

2. 建库方案选择¶

3. 宏基因组建库实操要点¶

宏基因组建库 Checklist：
☐ DNA 提取方法包含 bead-beating 步骤（确保难裂解菌也能破壁）
☐ 用 Qubit 精确定量（NanoDrop 对宏基因组样本不够准，容易被蛋白/盐干扰）
☐ 检查 DNA 完整性（跑凝胶或用 TapeStation 看是否降解）
☐ 如果起始量 <100ng，选择低起始量方案（Nextera XT / Flex）
☐ PCR 循环数尽量少（减少偏差，宏基因组需要真实反映群落组成）
☐ 片段大小建议 300-500bp（配合 PE150 测序，插入片段 ~200-350bp）
☐ 质检时注意：接头二聚体峰（~120-170bp）在宏基因组中更容易出现

不同应用的建库方案选择¶

WES 杂交捕获白话：WES 不是测全基因组，只测占基因组 ~1.5% 的外显子。方法是：先把全基因组打碎建库，然后用和外显子序列互补的 RNA 探针去"钓鱼"——只有和探针配对的 DNA 片段被留下（捕获），其余丢弃。这样用更少的数据量就能测到更高的外显子深度。

Index / Barcode 多样本混合测序（白话版）¶

为什么需要混样¶

一台测序仪（如 NovaSeq）一次能产出几 Tb 数据，但一个宏基因组样本可能只需要 10 Gb。如果一次只跑一个样本，就像包一辆大巴只坐一个人——太浪费了。

解决方案：多个样本混在一起上机（Pooling / Multiplexing），用"编号"来区分。

Index 是什么¶

每个样本的文库片段都带有独特的 Index 序列（也叫 Barcode）：

样本A的文库：  P5---[i5-A]---Rd1SP---DNA片段---Rd2SP---[i7-A]---P7
样本B的文库：  P5---[i5-B]---Rd1SP---DNA片段---Rd2SP---[i7-B]---P7
样本C的文库：  P5---[i5-C]---Rd1SP---DNA片段---Rd2SP---[i7-C]---P7

混合上机后，测序仪先读 Index 序列 → 知道这条 read 属于哪个样本 → 数据拆分（Demultiplexing）

白话解释：Index 就是"快递单号"。你的快递和别人的快递放在同一辆卡车里运（混合测序），到了快递站，工作人员根据快递单号（Index）把每个人的快递分开。

单 Index vs 双 Index¶

Index 跳跃（Index Hopping / Index Switching）¶

正常：  样本A的片段 → 带 Index-A → 拆分给样本A     ✓
异常：  样本A的片段 → 在 Flow Cell 上意外获得了 Index-B → 被误分给样本B  ✗

发生原因：游离的 Index 接头在 Flow Cell 上和错误的片段重组
发生率：Illumina 排列式 Flow Cell（如 NovaSeq 6000 的 ExAmp）上约 0.1-2%
解决方案：
  1. 使用 UDI（Unique Dual Index）
  2. 建库后彻底纯化去除游离接头
  3. 数据分析时过滤非预期的 Index 组合

混合比例计算¶

Pooling 计算公式：

等量混合（Equimolar Pooling）：
  每个样本的 loading 体积 = 目标总量 / 样本数 / 该样本浓度

示例：
  目标混合池浓度：4 nM，总体积 20 μL
  样本A 文库浓度：10 nM → 加 (4 × 20) / (10 × 6) = 1.33 μL
  样本B 文库浓度：8 nM  → 加 (4 × 20) / (8 × 6) = 1.67 μL
  ... 补水至 20 μL

白话解释：混样就像多个房间共用一条网线——你得按每个房间的带宽需求分配流量。测序深度需求大的样本多放点，需求小的少放点。

测序方案设计¶

PE vs SE（双端 vs 单端测序）¶

单端测序（SE, Single-End）：
  ──→                只从片段一端开始读

双端测序（PE, Paired-End）：
  ──→        ←──     从片段两端分别读
  Read 1     Read 2

  两条 Read 之间的距离 = Insert Size（插入片段大小）

选择建议： - 如果不确定，默认选 PE——多花 30-40% 的钱，信息量翻倍 - 只有在明确不需要配对信息时（如只做基因表达定量的 RNA-seq、ChIP-seq 峰检测）才选 SE

读长选择（Read Length）¶

读长怎么影响分析： - 读长太短 → 比对到基因组的唯一性（mappability）下降，重复区域分不清 - 读长太长 → 3' 端质量下降（Illumina 测序到后面质量越来越差） - PE150 是性价比最优的：150bp 足够在大多数基因组中实现高唯一比对率，又不会因为太长导致 3' 端质量暴跌

测序深度的计算与选择¶

核心公式：

测序深度（Coverage, ×） = (读长 × 读数 × 2[PE]) / 基因组大小

或者反过来算需要多少数据：
所需数据量（bp）= 目标深度 × 基因组大小

示例1：人全基因组 WGS，30× 覆盖
  所需数据量 = 30 × 3,000,000,000 = 90 Gb
  如果 PE150，需要 reads 数 = 90G / (150×2) = 3 亿对 reads

示例2：大肠杆菌基因组（~5 Mb），100× 覆盖
  所需数据量 = 100 × 5,000,000 = 500 Mb = 0.5 Gb

示例3：宏基因组（肠道菌群），目标 10 Gb/样本
  如果 PE150，需要 reads 数 = 10G / (150×2) = ~3333 万对 reads

各应用的推荐测序深度：

宏基因组示例项目（肠道宏基因组）：使用 PE150 测序方案，每样本约 5-10 Gb 数据量。选择 PE 是因为宏基因组组装和比对都需要配对信息来提高准确性。

建库与测序的完整工作流速查¶

实验设计阶段
  ├─ 确定科学问题 → 选择测序类型（WGS/WES/RNA-seq/宏基因组/16S...）
  ├─ 确定样本数量 → 计算所需总数据量 → 选择测序平台和流动槽
  ├─ 确定 PE vs SE → 选择读长 → 计算测序深度
  └─ 设计 Index 方案（几个样本混一个 Lane）

样本处理阶段
  ├─ 核酸提取 → Qubit 定量 + 完整性检查
  ├─ RNA 样本额外：polyA 富集 / rRNA 去除
  └─ 宏基因组额外：bead-beating 裂解 + 抑制物去除

建库阶段
  ├─ 片段化（超声/酶切）
  ├─ 末端修复 + A-tailing
  ├─ 接头连接（含 Index）
  ├─ PCR 扩增（尽量少循环）/ PCR-free
  ├─ 纯化 + 大小选择（磁珠/凝胶）
  └─ 文库质检（Qubit + Bioanalyzer + qPCR）

上机测序阶段
  ├─ 等量混合（Equimolar Pooling）
  ├─ 变性 + 稀释至 loading 浓度
  ├─ 加载到 Flow Cell → 上机运行
  └─ 数据输出：BCL → bcl2fastq 拆分 → FASTQ 文件

面试怎么答¶

Q1: 请简述 NGS 建库的基本流程¶

建库的核心目的是把样本 DNA 加工成测序仪能识别的标准格式。标准流程是六步：第一步把长 DNA 打碎成 300-500bp 的片段，可以用超声波打断或转座酶酶切；第二步末端修复加 A 尾，把断口磨平并加上一个 A 碱基方便后续连接；第三步接头连接，在片段两端接上包含测序引物位点和 Index 标签的 Adapter；第四步 PCR 扩增，把文库分子复制多份增加总量；第五步磁珠纯化和大小选择，去掉接头二聚体等杂质；第六步质检，用 Qubit 测浓度、Bioanalyzer 看片段分布、qPCR 测有效文库浓度。整个过程最关键的是接头连接和质检两步。

Q2: RNA-seq 建库和 DNA 建库有什么区别？¶

主要有三个区别。第一，RNA-seq 建库之前需要先做 rRNA 去除或 polyA 富集——因为 rRNA 占了总 RNA 的 80-90%，不去掉的话测出来都是 rRNA 浪费测序资源。如果研究的是真核 mRNA，通常用 Oligo-dT 磁珠富集带 polyA 尾的 mRNA；如果是原核生物或者需要看非编码 RNA，就用 RiboZero 等试剂去除 rRNA。第二，RNA 需要逆转录成 cDNA 才能建库——现在主流用的是链特异性建库方法，在合成第二链时掺入 dUTP，后续消化掉第二链，这样可以保留转录方向信息。第三，RNA 是单链且容易降解，操作上比 DNA 建库更需要注意 RNase 污染防护和低温操作。

Q3: 什么是 Index / Barcode？为什么需要双 Index？¶

Index 也叫 Barcode，是建库时加在每个样本文库片段上的短序列标签，通常 8-10 个碱基长。目的是让多个样本可以混在一起上机测序，测完后根据 Index 序列把数据拆分回各自样本，这个过程叫 Demultiplexing。之所以需要双 Index，也就是 i7 加 i5 两端都加标签，主要是为了解决 Index 跳跃问题——在某些 Flow Cell 上（如 NovaSeq 使用的排列式 Flow Cell），游离的接头可能和错误的片段重组，导致样本被错误分配。双 Index 大幅降低了这种误分率，现在更推荐使用 UDI（每个 i7+i5 组合都唯一）来进一步消除这个问题。

Q4: 宏基因组建库有哪些特殊注意事项？¶

宏基因组建库比单物种基因组建库复杂，主要有四个注意点。第一是 DNA 提取要采用 bead-beating 物理裂解加化学裂解的联合方案，因为不同微生物细胞壁硬度差异很大，只用化学法容易漏掉革兰氏阳性菌和芽孢杆菌。第二是要注意宿主 DNA 污染，人粪便样本中人源 DNA 可占到 10%-90%，建库后需要用 Bowtie2 等工具比对去宿主。第三是 PCR 循环数要尽量少，因为宏基因组需要真实反映群落组成比例，PCR 偏差会扭曲物种丰度。该 T2D 项目用的 Illumina PE150 方案，每样本约 5-10 Gb 数据量，能够覆盖大部分肠道微生物。第四是用 Qubit 而不是 NanoDrop 定量，因为粪便提取的 DNA 中常含蛋白和盐类杂质，NanoDrop 容易高估浓度。

Q5: PE150 是什么意思？怎么计算需要多少测序数据量？¶

PE150 指 Paired-End 150bp，就是从 DNA 片段两端各读 150 个碱基。PE 相比 SE（单端）的优势是信息量更大——两端的序列加上它们之间的距离关系，可以提高比对准确性和结构变异检测能力。计算数据量的公式是：所需数据量等于目标深度乘以基因组大小。比如人类全基因组 WGS 要 30 倍覆盖，基因组 3Gb，就需要 90Gb 数据。换算成 reads 数就是 90Gb 除以（150bp 乘以 2），等于 3 亿对 reads。对于宏基因组，因为不是单一基因组，通常按总数据量来规划，人肠道菌群一般 5-10 Gb 每样本就够做物种分类和功能分析了。

速查表¶

建库方法速查¶

测序方案速查¶

文库质检三件套¶

关键数字速记¶

延伸资源¶

1. Illumina Library Prep 官方指南：Illumina 官网提供各建库试剂盒的详细实验方案（Protocol）
   → 搜索 "Illumina Library Prep Protocols" 或访问 Illumina Support 页面

2. KAPA Library Quantification Kit 技术手册：qPCR 定量文库的标准方案
   → Roche / KAPA Biosystems 官网

3. Illumina Experiment Design 工具：在线计算测序深度和数据量需求
   → 搜索 "Illumina Sequencing Coverage Calculator"

4. Nature Protocols：Metagenomics library preparation：宏基因组建库的标准化方案
   → Quince et al. (2017) Nature Biotechnology "Shotgun metagenomics, from sampling to analysis"

5. 视频推荐：iBiology "Next Generation Sequencing - Library Preparation" 系列
   → YouTube 搜索 "iBiology NGS library preparation"

最后更新：2026-05-03 | 编写说明：本文档专为面试准备编写，聚焦"建库方法 + 测序方案设计"，与第13篇（测序平台原理）互补。建库六步流程、RNA 特殊步骤、Index 混样、深度计算是面试高频考点。