665 单细胞微生物组学¶

# 单细胞宏基因组分析流程

# 1. 样本处理和单细胞分离
# 使用微流控设备（如Atrandi SPC系统）
# 将样本中的细菌逐个包裹在半透膜微胶囊(SPC)中
# SPC允许试剂进出但DNA留在胶囊内

# 2. 胶囊内MDA扩增
# MDA (Multiple Displacement Amplification) 扩增单个细菌的基因组
# phi29 DNA聚合酶在等温条件下扩增全基因组

# 3. 条形码标记和测序
# Split-and-pool组合条形码策略
# 每个胶囊获得唯一条形码组合
# 短读长测序（Illumina）

# 4. 生信分析流程
# 按条形码拆分reads → 每个细菌的reads
# 组装 → 单扩增基因组(SAG)
# 质量评估 → CheckM
# 分类注释 → GTDB-Tk

# 单细胞宏基因组数据分析
import pandas as pd  # 数据处理
import numpy as np  # 数值计算
from collections import Counter  # 计数器

def analyze_sag_quality(checkm_results):
    """评估单扩增基因组(SAG)质量"""
    df = pd.read_csv(checkm_results, sep='\t')

    # 质量分级（MIMAG标准）
    high_quality = df[(df['Completeness'] > 90) &
                      (df['Contamination'] < 5)]  # 高质量：>90%完整，<5%污染
    medium_quality = df[(df['Completeness'] > 50) &
                        (df['Contamination'] < 10)]  # 中质量

    print(f"总SAG数: {len(df)}")
    print(f"高质量SAG: {len(high_quality)} ({len(high_quality)/len(df)*100:.1f}%)")
    print(f"中质量SAG: {len(medium_quality)} ({len(medium_quality)/len(df)*100:.1f}%)")

    # 物种组成
    taxa = Counter(df['Taxonomy'].apply(lambda x: x.split(';')[-1]))  # 最低分类级别
    print("\nTop10物种:")
    for species, count in taxa.most_common(10):
        print(f"  {species}: {count} cells")

    return high_quality, medium_quality

# 菌株异质性分析
def strain_heterogeneity(sag_snps_file):
    """分析同一物种不同单细胞之间的SNP差异"""
    snps = pd.read_csv(sag_snps_file, sep='\t')

    # 计算成对SNP距离
    from scipy.spatial.distance import pdist, squareform
    snp_matrix = snps.pivot(index='cell_id', columns='position', values='alt_allele')
    snp_matrix = snp_matrix.fillna(0)

    distances = pdist(snp_matrix.values, metric='hamming')  # Hamming距离
    dist_matrix = squareform(distances)

    print(f"同种内平均SNP距离: {np.mean(distances):.4f}")
    print(f"最大SNP距离: {np.max(distances):.4f}")

    return dist_matrix

# 细菌单细胞RNA-seq分析概念流程
import scanpy as sc  # 单细胞分析工具包
import anndata as ad  # 注释数据格式

# 1. 读取数据（假设已处理为count矩阵）
adata = sc.read_h5ad("bacterial_scrna.h5ad")  # 读取数据
print(f"细胞数: {adata.n_obs}, 基因数: {adata.n_vars}")

# 2. 质量控制（细菌特殊考虑）
# 细菌mRNA含量远低于哺乳动物，阈值要低很多
sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=20)  # 至少检测到20个基因
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=3)   # 至少在3个细胞中检测到
print(f"过滤后: {adata.n_obs} 细胞, {adata.n_vars} 基因")

# 3. 归一化（注意：不能用常规scRNA-seq的方法）
# 细菌没有polyA尾，reads分布与哺乳动物不同
sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4)  # 总量归一化
sc.pp.log1p(adata)  # log转换

# 4. 降维和聚类
sc.pp.highly_variable_genes(adata, n_top_genes=200)  # 高变异基因
sc.pp.pca(adata, n_comps=20)  # PCA降维
sc.pp.neighbors(adata, n_pcs=15)  # 构建KNN图
sc.tl.umap(adata)  # UMAP降维
sc.tl.leiden(adata, resolution=0.5)  # Leiden聚类

# 5. 物种鉴定（每个cluster）
# 使用16S/23S rRNA reads鉴定物种
sc.tl.rank_genes_groups(adata, 'leiden', method='wilcoxon')  # 差异基因

# 6. 可视化
sc.pl.umap(adata, color=['leiden', 'species'], save='_bacterial_scrna.pdf')

# 从单细胞数据检测噬菌体感染
def detect_phage_infection(adata, phage_gene_list):
    """
    在单细胞数据中检测噬菌体感染
    phage_gene_list: 已知噬菌体基因列表
    """
    # 检查每个细胞中噬菌体基因的表达
    phage_genes_present = [g for g in phage_gene_list if g in adata.var_names]
    print(f"检测到 {len(phage_genes_present)} 个噬菌体基因")

    if phage_genes_present:
        # 计算噬菌体基因表达得分
        sc.tl.score_genes(adata, phage_genes_present, score_name='phage_score')

        # 标记感染细胞
        threshold = adata.obs['phage_score'].quantile(0.9)  # Top 10%为感染
        adata.obs['phage_infected'] = adata.obs['phage_score'] > threshold

        n_infected = adata.obs['phage_infected'].sum()
        print(f"疑似噬菌体感染细胞: {n_infected}/{adata.n_obs} "
              f"({n_infected/adata.n_obs*100:.1f}%)")

        # 分析感染 vs 非感染细胞的差异
        sc.tl.rank_genes_groups(adata, 'phage_infected', method='wilcoxon')

    return adata

Bascet: 高通量scMetaG实验+计算框架
- 新型微流控实现高强度裂解+基因组扩增
- 支持数千个单细胞并行处理
- Zorn是配套的计算分析工具

Nature Reviews Genetics (2025) 综述要点：
- 单细胞微生物组学被列为2025年7大新兴技术之一
- 结合meta-omics和单细胞基因组学提供新机会
- 主要瓶颈：技术挑战和高成本

# 单细胞微生物组技术选择
想要基因组信息 → scMetaG (SPC/微流控+MDA)
想要转录组信息 → M3-seq / smRandom-seq2
只关注少数目标种 → ProBac-seq (10X兼容)
需要高通量 → Bascet/Zorn (2025)

# SAG质量标准(MIMAG)
高质量: 完整度>90%, 污染<5%, 含16S/23S/5S, ≥18 tRNA
中质量: 完整度>50%, 污染<10%
低质量: 完整度<50%

# 关键统计
每个细菌mRNA分子数: ~1000-5000（哺乳动物: 10万-50万）
细菌mRNA半衰期: 几分钟（哺乳动物: 几小时）
典型scMetaG基因组完整度: 10-60%（需大量细胞合并）